黃芩莖葉總黃酮對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷的實(shí)驗(yàn)研究＊

龔明玉，閆鳳霞，劉永平，金曉萍，楊鶴梅

(1.承德醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室，河北承德 067000;2.承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科，河北承德 067000)

心肌缺血再灌注損傷(Myocardium ischemia reperfusion injury，MIRI)是臨床常見(jiàn)的病理過(guò)程，隨著急性心肌梗死再灌注治療的普及而備受重視。心肌缺血再灌注損傷與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，其中心環(huán)節(jié)是自由基等所致脂質(zhì)過(guò)氧化損傷。黃芩莖葉總黃酮(Scutellaria Baicalensis stem-leaf Total Flavonoid，SSTF)是本院重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室—中藥研究所研究開(kāi)發(fā)的黃酮類(lèi)化合物，具有抗氧自由基及抗心肌缺血、保護(hù)心肌的作用。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)大鼠心肌缺血再灌注損傷模型，探討SSTF是否對(duì)心肌缺血再灌注損傷有保護(hù)作用。

1 材料

1.1 藥物

SSTF純度為61.8%，批號(hào)010608，由本院省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室——中藥研究所提供，用飽和NaHCO3溶解后灌胃。LDH、SOD、MDA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程所。

1.2 動(dòng)物

健康SD大鼠40只，體重230g±20g，雌雄各半。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組及處理

40只SD大鼠隨機(jī)分為SSTFⅠ組、SSTFⅡ組、SSTFⅢ組、缺血再灌注組和假手術(shù)組5組，每組8只。其中SSTF 3組大鼠于手術(shù)前1周分別灌胃不同劑量的 SSTF(17.5mg/kg/d、35mg/kg/d、70mg/kg/d)，連用7d;缺血再灌注組和假手術(shù)組大鼠術(shù)前分別給予相應(yīng)容積的生理鹽水，時(shí)間同SSTF組。

2.2 心肌缺血再灌注模型的制備

10%烏拉坦腹腔注射麻醉(1ml/100g)，仰臥位固定，用針型電極插入大鼠四肢皮下記錄標(biāo)準(zhǔn)肢體II導(dǎo)聯(lián)心電圖。于胸骨左緣3～4肋間切開(kāi)胸壁，暴露心臟。①心肌缺血再灌注組:在左心耳與肺動(dòng)脈干之間結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈的前降支，同時(shí)在結(jié)扎線與血管之間穿一直徑2mm長(zhǎng)5mm的硅膠管，結(jié)扎30min;然后剪斷縫合線，取出硅膠管，再灌注2h;②假手術(shù)組:僅分離前降支并穿過(guò)絲線，但不結(jié)扎;③SSTF組:手術(shù)前給予不同劑量SSTF灌胃(17.5 mg/kg/d、35mg/kg/d、70mg/kg/d)，連用 1 周，結(jié)扎30min，再灌注 2h。

2.3 取材

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，頸總動(dòng)脈取血3ml，分離血清置－20℃冰箱保存待測(cè)。取血后迅速取出心臟，置冰冷鹽水中沖洗殘血，一部分置于－20℃冰箱保存，另一部分用70%乙醇固定。

2.4 指標(biāo)檢測(cè)

2.4.1 流式細(xì)胞方法測(cè)定細(xì)胞凋亡率 將70%乙醇固定的心肌組織用機(jī)械法分離，收集單細(xì)胞懸液，經(jīng)100目尼龍網(wǎng)過(guò)濾離心，沉淀5min，加PBS洗滌，再次離心沉淀后，用溴化乙錠一步插入法進(jìn)行DNA染色，由流式細(xì)胞儀測(cè)定。將所得數(shù)據(jù)輸入計(jì)算機(jī)，經(jīng)Cell quest軟件處理，分析細(xì)胞的凋亡率。

2.4.2 血漿乳酸脫氫酶(LDH)活性測(cè)定 按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

2.4.3 心肌組織丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)的檢測(cè) 取缺血區(qū)心肌組織200mg，在冰浴下制備10%心肌組織勻漿。用硫代巴比妥酸(TBA)法測(cè)定MDA含量。用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定SOD活性。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠心肌細(xì)胞的凋亡情況

表1顯示，模型組與假手術(shù)組相比，細(xì)胞凋亡率明顯增加(P<0.01)，SSTF組細(xì)胞凋亡率均明顯低于模型組(P<0.05，0.01)，提示SSTF可抑制缺血再灌注大鼠心肌細(xì)胞的凋亡。

表1 各組大鼠心肌細(xì)胞的凋亡情況(n=8，±s)

表1 各組大鼠心肌細(xì)胞的凋亡情況(n=8，±s)

注:與假手術(shù)組比較:*P<0.01;與模型組比較:△P<0.05，△△P<0.01

組別 給藥劑量(mg/kg/d)細(xì)胞凋亡率%假 手 術(shù) 組 —1.48±0.7模 型 組 — 16.34±2.08*SSTF Ⅰ 組 17.5 14.27±1.96△SSTF Ⅱ 組 35.0 12.18±1.81△△SSTF Ⅲ 組 70.0 9.85±1.43△△

3.2 各組大鼠心肌組織SOD活性、MDA含量及血清LDH活性的變化

表2顯示，與假手術(shù)組比較，IR組心肌組織中SOD活性顯著降低(P<0.01)，MDA含量明顯升高(P<0.01)，血清LDH活性顯著升高(P<0.01);同缺血再灌注組比較，SSTF各組心肌組織中SOD活性升高(P<0.05，0.01)，MDA含量降低(P<0.05，0.01)，血清LDH活性明顯降低(P<0.01)。

表2 各組大鼠心肌組織SOD活性、MDA含量及血清LDH活性的變化(±s，n=8)

表2 各組大鼠心肌組織SOD活性、MDA含量及血清LDH活性的變化(±s，n=8)

注:與假手術(shù)組比較:*P<0.01;與模型組比較:△P<0.05，△△P<0.01

組別 SOD(nmol/g/L)MDA(nmol/ml)LDH(U/L)256.1±71.83 3.25±0.84 578±21.26模 型 組102.29±51.84* 6.87±1.68* 947±64.45*SSTF Ⅰ 組 186.45±54.68△ 5.20±1.16△ 886±52.13△SSTF Ⅱ 組 218.32±57.76△△ 4.76±0.98△△ 683±40.28△△SSTF Ⅲ 組 224.56±61.65△△ 4.28±0.91△△ 632±36.09假手術(shù)組△△

4 討論

近年的研究表明，脂質(zhì)過(guò)氧化作用及能量代謝異常是導(dǎo)致心肌缺血及再灌注損傷的2個(gè)重要因素。心肌缺血時(shí)，由于心肌內(nèi)源性氧自由基清除劑減少，氧自由基大量堆積;再灌注后，分子氧重新進(jìn)入心肌組織中，氧自由基水平進(jìn)一步上升，作用于心肌細(xì)胞膜，使膜磷脂結(jié)構(gòu)中不飽和脂肪酸過(guò)氧化，導(dǎo)致細(xì)胞膜機(jī)械性損傷。心肌線粒體破潰、細(xì)胞腫脹、功能障礙甚至死亡。心肌缺血再灌注損傷后超氧化物歧化酶(SOD)活性下降，使氧自由基增多，從而氧自由基氧化不飽和脂肪酸釋放的降解產(chǎn)物丙二醛(MDA)含量升高，丙二醛可引起大分子物質(zhì)如蛋白質(zhì)、脂類(lèi)等相互交聯(lián)、聚合，從而破壞了細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能;使胞漿酶(如肌酸激酶及其同工酶，乳酸脫氫酶等)釋放增加，加速了心肌細(xì)胞損害程度，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)觀察到，心肌缺血再灌注損傷時(shí)自由基清除劑SOD的活性明顯降低，自由基脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA含量明顯升高，表明MIRI時(shí)存在明顯的自由基代謝紊亂。經(jīng)SSTF治療后，SSTF干預(yù)組SOD活性明顯升高，LDH活性明顯下降，MDA濃度明顯下降，表明SSTF具有較強(qiáng)的抗氧化作用，能增強(qiáng)缺血心肌的抗氧化能力，抑制心肌缺血再灌注后心肌細(xì)胞的凋亡，減輕和保護(hù)MIRI所致的心肌損傷。其作用機(jī)制可能是在細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化過(guò)程中，一方面減少自由基的產(chǎn)生，加速ORF的清除，另一方面通過(guò)激活細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶SOD的活性，抑制ORF，降低脂質(zhì)過(guò)氧化物，從而發(fā)揮抗脂質(zhì)過(guò)氧化的作用。