中藥復合多糖體內外抗腫瘤活性實驗研究*

曹志然，王 潔，王 蓓，戎瑞雪，唐志遠，王 海

(河北大學 基礎醫(yī)學院，河北 保定 071000)

近年來，中藥多糖的抗腫瘤及免疫調節(jié)作用日益受到人們的關注。從中藥中提取的活性多糖，其抗腫瘤活性主要是通過其對機體免疫系統(tǒng)的保護和調節(jié)作用實現(xiàn)的[1]，多無毒，對正常細胞沒有殺傷作用，可以克服化療、放療過程中對正常細胞的損傷[2]，成為近幾年抗腫瘤藥物研究的熱點之一。國內已對多種多糖的抗腫瘤及免疫調節(jié)作用進行了研究，但多數研究大都限于某種中藥多糖成分，或僅僅是2種多糖簡單的組合，如當歸多糖、黃芪多糖、柘樹根多糖、甘草多糖，對從中藥方劑中提取的復合多糖抗腫瘤免疫調節(jié)作用的研究還比較少。中藥多系按照中醫(yī)理論組方用藥，復方是中藥的精髓，最能體現(xiàn)中醫(yī)用藥特色。現(xiàn)有研究表明，多糖復合作用時，效果比單味多糖更佳，具有顯著的抗腫瘤、提高免疫功能的作用，且其之間的藥理作用呈現(xiàn)協(xié)同性[3]。本研究依據中藥復方的理念，從經典的補血益氣方劑十全大補湯中提取復合多糖，通過建立荷瘤小鼠模型及體外細胞培養(yǎng)的方法對復合多糖體內外抗腫瘤活性及免疫調節(jié)作用進行了初步探討，旨在為研制復合多糖抗腫瘤藥物及免疫輔助藥物的臨床應用提供理論和實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物及瘤株 昆明種雄性小鼠，體重20g±2.0g，40只，由河北醫(yī)科大學實驗動物中心提供，許可證號 SCXK(冀)2008-1-003，合格證號901027。H22(小鼠肝癌實體型瘤株)和 Hela(人宮頸癌細胞株)由河北醫(yī)科大學提供。

1.1.2 藥品、試劑及主要儀器 人參、白術、茯苓、甘草、當歸、川芎、白芍、熟地黃、黃芪、肉桂購自保定市藥材公司，經本院馮天鑄教授鑒定均合格。RPMI-1640培養(yǎng)液干粉(美國 Gibco公司);新生牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)，MTT(AMRESCO公司)。刀豆蛋白 A、脂多糖均為Solarbio公司產品，HF90二氧化碳培養(yǎng)箱(上海力申科學儀器有限公司)。倒置顯微鏡(日本Olympus)，ELX-800全自動酶標儀(美國寶特有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 復合多糖的提取 人參32g，白術32g，茯苓 32 g，甘草 16g，當歸 48g，川芎 16 g，白芍 32g，熟地黃48g，黃芪32g，肉桂8g(共296g)，加20倍體積水回流提取 3次，分別為 1h，1h，0.5h，合并提取液，放冷后高速離心(6000r/min);將上清液減壓回收至5倍體積，加乙醇至含醇量為80%，靜置24h，高速離心(6000r/min);將上述沉淀加5倍體積水溶解，加硫酸銨至無沉淀產生，加0.5%活性炭脫色，加熱、抽濾后棄去沉淀;將濾液加乙醇至含醇量為80%靜置24h，高速離心(6000r/min);少量80%乙醇洗滌多次，去除多余硫酸銨，沉淀以少量水溶解，冷凍干燥，即為精多糖部分，重量為56g，多糖獲得率為18.92%。

1.2.2 H22荷瘤小鼠模型的建立 無菌條件下抽取接種7d，生長良好的H22荷瘤小鼠腹水(活癌細胞數>95%)，用無菌生理鹽水制成細胞數為5×106·ml－1的細胞懸液，小鼠右腋部皮下接種，0.2ml/只。

1.2.3 分組與給藥途徑 40只雄性昆明種小鼠接種腫瘤細胞24h后稱重，隨機分為5組:1組為模型對照組;2-5組為用藥組(2組為順鉑(DDP)陽性對照組;3組為順鉑+高劑量復合多糖組;4組為順鉑+中劑量復合多糖組;5組為順鉑+低劑量復合多糖組)。3組 ～5組分別用168.4mg.ml－1、84.2 mg.ml－1、42.1mg·ml－1復合多糖灌胃給藥，每天每只0.5ml，連續(xù)10 d;2組～5組腹腔注射順鉑，每天每只0.02mg，連續(xù)10d，1組用等量溫開水灌胃和生理鹽水腹腔注射。

1.2.4 復合多糖對荷瘤小鼠腫瘤生長及一般狀況的影響 末次給藥后24h將小鼠稱重，眼眶取血，全自動血細胞分析儀計數白細胞、紅細胞、血紅蛋白;脫頸處死小鼠，75%乙醇浸泡消毒，解剖摘取瘤塊、用濾紙吸干后稱重，計算抑瘤率。同時觀察實驗過程中實驗動物的一般情況及進食量。

1.2.5 復合多糖對荷瘤小鼠脾指數及T、B淋巴細胞增殖的影響 采用 MTT法[4]。無菌摘取小鼠脾臟并稱重，制備脾細胞懸液，用1640完全培養(yǎng)液調整細胞密度為5×106·ml－1，將細胞懸液加至96孔培養(yǎng)板中，90μl/孔，設 Con A刺激組(終濃度為 5μg· ml－1)、LPS 刺激組 (終濃度為 10μg·ml－1)和無血清培養(yǎng)液對照組，每組3個復孔。將96孔板置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)68h后加入5mg·ml－1的MTT 15ul，繼續(xù)培養(yǎng)4h，培養(yǎng)結束后棄上清，每孔加DMSO 150ul，震蕩5min，酶標儀測490nm波長下的OD值，計算刺激指數。

1.2.6 復合多糖體外抑瘤作用 采用MTT比色法。Hela細胞用1640完全培養(yǎng)液(含10%熱滅活胎牛血清，0.2%NaHCO3，100U·ml－1青霉素、100μg·ml－1鏈霉素、3mmol·l－1L-谷氨酰胺)，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，按貼壁方法培養(yǎng)。收集對數生長期的細胞，制備單細胞懸液，調整細胞密度為2 ×104·ml－1，以 90μl/孔接種于 96 孔培養(yǎng)板中，置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，復合多糖組分別加入終濃度為 200μg·ml－1、100μg·ml－1、50μg·ml－1、25μg· ml－1、12.5μg· ml－1的 復 合 多 糖10μl，每個濃度設3個復孔，對照組加入等量無血清1640培養(yǎng)液;置培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，分別于20h、44h、68h 取出培養(yǎng)板，每孔加 5mg·ml－1的 MTT 15μl，4h 后終止培養(yǎng)，棄上清加 DMSO 150μl，震蕩5min，酶標儀測490 nm波長下的光密度(OD)值，并計算細胞增殖抑制率(IR)。

1.2.7 數據處理 用SPSS16.0軟件處理，各組數據由s表示，組間兩兩比較采用方差分析中的兩兩比較t檢驗。

2 結果

2.1 復合多糖對H22荷瘤小鼠體重及瘤重的影響

表1顯示，小鼠接種瘤細胞4d后飲食減少、皮毛無光澤，均可觸及皮下腫塊。用藥組荷瘤小鼠增重量均較模型對照組低，高、中劑量多糖組與順鉑合用組與單純順鉑組比較，小鼠體重明顯增加(P<0.05)。用藥組與模型對照組相比，瘤重均明顯減輕(P<0.05)，單獨使用順鉑抑瘤率為22%，當順鉑和不同劑量的復合多糖聯(lián)用時，高、中劑量組抑瘤率分別增加至36%、37%。

表1 復合多糖對H22荷瘤小鼠體重及瘤重的影響(s)

表1 復合多糖對H22荷瘤小鼠體重及瘤重的影響(s)

注:與模型對照組比較:*P<0.05;與順鉑組比較:▲P<0.05

組抑瘤率模型對照組別 例 數 體重變化(g)瘤重(g)DDP 8 3.02±1.93* 1.05±0.21* 22%DDP + PSC(168.4mg·ml－1) 8 3.93±1.74*▲ 0.87±0.28*▲ 36%DDP +PSC(84.2 mg·ml－1)8 3.49±0.99*▲ 0.85±0.25*▲ 37%DDP+PSC(42.1 mg·ml－1)8 2.98±1.21*1.05±0.27 22%

2.2 復合多糖對荷瘤小鼠 WBC、RBC、HGB數及脾指數的影響

表2顯示，與模型對照組相比，順鉑組小鼠白細胞數顯著降低(P<0.05)，復合多糖組沒有顯著性差異;與順鉑組相比，不同劑量復合多糖組白細胞數顯著增加(P<0.05)，中劑量復合多糖組紅細胞、血紅蛋白數增加明顯。順鉑組的脾指數顯著低于模型對照組(P<0.01)，復合多糖+順鉑組脾指數顯著高于順鉑組(P<0.05)，且隨復合多糖藥物濃度的增大而增大。

表2 復合多糖對荷瘤小鼠WBC、RBC、HGB數及脾指數的影響(s)

表2 復合多糖對荷瘤小鼠WBC、RBC、HGB數及脾指數的影響(s)

注:與模型對照組比較:*P<0.05，**P<0.01;與順鉑組比較:▲P<0.05

組別 例數 WBC(109·L－1)RBC(1012·L－1)HGB(g·L－1)脾指數(mg·g－1)6.87±0.68 7.94±0.79 112.2±13.5 7.18±1.34 DDP 8 5.11±0.92* 7.95±0.98 123.8±18.0 3.59±0.68**DDP + PSC(168.4mg·ml－1)8 7.12±0.53▲ 8.01±0.45 131± 6.4 5.73 ±0.56*▲DDP + PSC(84.2 mg·ml－1)8 6.61±0.34▲ 9.06±0.55▲ 139± 6.4▲ 4.67±0.89*▲DDP + PSC(42.1 mg·ml－1)8 6.18±1.12▲ 8.18±1.11 120.6± 9.6 3.48±0.88模型對照組8*

2.3 復合多糖對荷瘤小鼠T淋巴細胞、B淋巴細胞增殖的影響

表3 復合多糖對荷瘤小鼠T淋巴細胞、B淋巴細胞增殖的影響(s)

表3 復合多糖對荷瘤小鼠T淋巴細胞、B淋巴細胞增殖的影響(s)

注:與模型對照組比較:*P<0.05，*P<0.01;與順鉑組比較:▲P<0.05，▲▲P<0.01

模型對照組DDP 8 1.35±0.158* 1.39±0.20*DDP +PSC(168.4mg·ml－1) 8 2.44 ±0.66**▲▲ 2.07 ±0.41**▲▲DDP+PSC(84.2 mg·ml－1)8 1.94 ±0.329**▲▲ 1.68 ±0.47*▲DDP+PSC(42.1 mg·ml－1)8 1.567 ±0.23*▲1.36±0.27

表3顯示，與模型對照組比較，高中劑量復合多糖治療后荷瘤小鼠的脾淋巴細胞轉化能力顯著高于模型對照組(P<0.01)，而順鉑治療后轉化能力明顯降低(P<0.05);與順鉑組比較，順鉑和不同濃度的復合多糖聯(lián)用可顯著增強脾淋巴細胞的轉化能力(P<0.05或 P<0.01)。

2.4 復合多糖對腫瘤細胞增殖的抑制作用

表4顯示，同一作用時間下，細胞增殖抑制率隨復合多糖濃度的增加而顯著提高;相同復合多糖濃度下，隨作用時間的延長，抑制率有明顯增大趨勢。

3 討論

惡性腫瘤目前以手術、放療、化療為主，手術多適用于早期癌癥患者，放療、化療只對敏感瘤株有效，且會出現(xiàn)嚴重的毒副反應和后遺癥，同時腫瘤的發(fā)生、發(fā)展往往伴有機體免疫功能的降低。近年來，國內外學者證實多糖不僅是一種良好的抗腫瘤物質，而且其促進和恢復機體免疫功能的作用較為突出，因此中藥活性多糖的抗癌作用受到越來越多的重視。

表4 復合多糖對腫瘤細胞增殖的抑制作用(s)

表4 復合多糖對腫瘤細胞增殖的抑制作用(s)

注:與對照組比較:*P<0.01

組別24h 48h 72h OD IR(%)OD IR(%)OD IR(%)對照組46.3 0.72±0.01 0.82±0.01 0.90±0.01 1 0 0 μg · ml－1 0.46±0.01* 31.6 0.42±0.02* 43.4 0.38±0.01* 55.2

本研究中的復合多糖從經典的補血益氣方劑-十全大補湯中提取，其組成成分黃芪、當歸、甘草等均具有確切的抗腫瘤活性。根據中藥復方配伍的理念，復合多糖提高了對腫瘤細胞的抑制和殺傷作用。本實驗對復合多糖進行了體內外抗腫瘤及免疫調節(jié)功能的研究，復合多糖體外實驗結果顯示，其對Hela細胞增殖有明顯抑制作用，且呈時間-劑量依賴性。體內實驗結果顯示，復合多糖與順鉑聯(lián)用具有協(xié)同抗小鼠H22肝癌的作用，在荷瘤小鼠用藥10d后，與順鉑組比較，順鉑聯(lián)合復合多糖3個劑量組均能顯著提升脾指數、白細胞數，拮抗順鉑引起的免疫抑制作用。同時復合多糖可使ConA和LPS激發(fā)的T細胞、B細胞增殖反應明顯增強，表明復合多糖對T細胞、B細胞的功能具有增強作用，可以通過增強荷瘤小鼠的細胞免疫、體液免疫功能而發(fā)揮一定的抗腫瘤效應。觀察各組小鼠還發(fā)現(xiàn)，復合多糖組小鼠一般狀態(tài)良好，外觀、毛色、大便、活動、體重增長等均較順鉑組明顯改善，說明復合多糖可拮抗順鉑的毒副作用。

綜上所述，中藥復合多糖體內外均顯示明顯的抗腫瘤活性，與順鉑聯(lián)用可產生協(xié)同增效作用，具有良好的應用前景。

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