抵當芪桂湯對STZ誘導糖尿病大鼠vWF、HbA1c的影響*

趙天才，楊景鋒，李月紅，袁志敏，張 瑛，李 鵬，張瀚元

(陜西中醫學院，陜西咸陽 712046)

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是由于胰島素分泌和(或)作用缺陷所引起的以慢性血葡萄糖(簡稱血糖)水平增高為特征的代謝性疾病[1]。其發病率高，并發癥遍及全身各重要器官。血管病變是各并發癥的基礎病變，血管內皮細胞功能障礙是形成糖尿病血管并發癥的基礎[2]。血管性血友病因子(vWF)和糖化血紅蛋白(HbA1c)可以有效反映糖尿病血管內皮功能的狀態和血糖水平對血管內皮細胞功能的影響。本實驗旨在觀察抵當芪桂湯(原名抵當四五湯)對糖尿病大鼠vWF和HbA1c含量的影響，探討該方對糖尿病及其并發癥的作用機理，為臨床用藥提供依據。

1 材料與方法

1.1 動物、藥品及主要試劑

成年SD雌性大鼠90只，體重200g±20g，由西安交通大學實驗動物中心提供，合格證號醫動字第2008-08號。抵當芪桂湯由生黃芪、炒白芍、酒大黃、桂枝、水蛭、鬼箭羽組成。給藥劑量按照文獻方法計算[3]，經常規煎煮、過濾、水浴蒸發至每毫升含生藥量分別為0.87g和1.73g的濃縮液，置4℃冰箱保存備用。達美康:天津華津制藥廠，批號080405;鏈脲佐菌素(STZ):sigma公司，批號SO245;血糖試紙:德國羅氏診斷有限公司，批號1630-2005;vWF試劑盒:上海西唐生物技術有限公司，批號081023;HbA1c試劑盒:南京建成生物工程研究所，批號20081120;722E型分光光度計:上海光譜儀器有限公司;全活力型羅康全血糖儀:德國羅氏診斷公司;1379型洗板機:北京賓達英創科技有限公司;RT-2100C型酶標儀:上海光達電器廠。

1.2 模型制備及干預方法

大鼠適應性喂養1周，稱體重并經尿糖定性檢測為陰性后隨機抽取10只為空白組(A組)，其余大鼠用鏈脲佐菌素(STZ)60mg/kg(STZ溶于0.1mol/L、ph4.2的枸櫞酸緩沖液中，配制為1%的溶液)于大鼠禁食12h后1次性腹腔注射，72h后測其血糖值≥16.9mmol/L、尿糖+++～++++以上為造模成功。篩選造模成功大鼠65只隨機分為模型組(B組)、達美康組(C組)、抵當芪桂湯組(D組)、抵當芪桂湯加達美康組(E組)、抵當芪桂湯大劑量組(F組)，每組13只。各組大鼠造模后第4天開始灌胃給藥，1次/d，連續8周。給藥劑量分別為:A、B組:蒸餾水2ml;C組:達美康(2mg/ml)混懸液2ml;D組:抵當芪桂湯(含生藥量0.87g/ml)濃縮液2ml;E組:抵當芪桂湯(0.87g/ml)濃縮2ml，30min后給予達美康(2mg/ml)混懸液2ml;F組:抵當芪桂湯(生藥量1.73g/ml)濃縮液2ml。

1.3 觀察指標及標本采集

每天觀察大鼠進食、飲水、尿量及活動情況;給藥后第8周末處死動物，右心室取血，其中4ml置以肝素抗凝管中，用葡萄糖氧化酶法測定空腹血糖，比色法測HbA1c;剩余血液置離心管中，4℃離心取血清分裝，置－20℃冰箱保存備用，并用ELISA雙抗體夾心法檢測vWF的含量。剪取心尖部心肌組織用10%多聚甲醛固定，梯度酒精脫水，石蠟切片4μm，脫水透明，HE染色，10×40倍光鏡下觀察攝片。

1.4 統計分析

用SPSS15.0統計軟件進行分析。計量數據以均數±標準差(s)表示，組間比較采用單因素方差分析，相關分析采用簡單線性相關分析，P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠的一般狀況

造模前各組大鼠精神狀態、飲食、尿量正常，均反應靈活，動作自如。造模后大鼠表現為多飲、多食、多尿，形體消瘦，嗜睡少動，精神倦怠。給藥8周后，C、D、E、F組多飲、多食、多尿癥狀有不同程度減輕，精神狀態好轉，與A組比較次之;B組上述癥狀變化不明顯。

2.2 抵當芪桂湯對大鼠空腹血糖的影響

表1顯示，造模3d后與空白組比較，STZ誘導糖尿病模型大鼠空腹血糖明顯升高(P<0.05)，表明造模成功。干預結束后，與B組比較各干預組大鼠空腹血糖均明顯下降(P<0.05)，其中以C組下降明顯。

表1 治療前后各組大鼠空腹血糖含量比較(s)

表1 治療前后各組大鼠空腹血糖含量比較(s)

注:*P<0.05 vs.A group，#P<0.05 vs.B group.A:blank control group，B:model group， C:diamicron group D:Di-Dang-Qi-Gui Decoction group E:Di-Dang-Qi-Gui Decoction and diamicron group F:maximum dosage group of the Decoction，the same below

Group n Blood Glucose(mmol/L)3rd day 8th week A 10 6.26±0.44 5.95±0.58 B 11 23.43±3.07* 25.55±2.72*C 12 21.09±2.05* 13.34±2.76*#D 13 22.54±3.36* 19.49±3.09*#E 13 23.51±2.44* 19.28±4.90*#F 13 21.91±3.05* 20.38±5.11*#

2.3 抵當芪桂湯對大鼠vWF、HbA1c含量的影響

表2顯示，干預結束后與A組比較，B組vWF、HbA1c明顯升高(P<0.05)，表明糖尿病血管病變中vWF隨著HbA1c增高而急劇增高;與B組比較，各干預組大鼠vWF、HbA1c含量均降低，其中以D組降低最為顯著(P<0.05)，D組與C組相比差異顯著(P<0.05)。

表2 治療8周后各組大鼠vWF、HbA1c含量比較(s)

表2 治療8周后各組大鼠vWF、HbA1c含量比較(s)

*P<0.05 vs.A group，#P<0.05 vs.B group，<0.05 vs.C group

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2.4 vWF、HbA1c的相關性分析

圖1顯示，對vWF、HbA1c的相關性進行分析，可以看出隨著HbA1c的升高，vWF呈現急劇升高的趨勢，其相關系數為r=0.9692(P<0.0001)，具有明顯的正相關關系。

圖1 大鼠vWF與HbA1c的相關關系圖

2.5 各組大鼠心肌組織形態特征的變化

圖2顯示，正常大鼠心肌細胞排列整齊致密，細胞間質較少，細胞核分布均勻一致，肌纖維整齊，無明顯斷裂。STZ誘導糖尿病模型大鼠心肌細胞排列紊亂，間質及間質膠原較多，間質纖維化明顯，肌纖維部分斷裂。經干預后各組大鼠的心肌細胞排列紊亂有不同程度的恢復，其中以C組和D組恢復較為明顯。

圖2 各組大鼠心肌組織結構圖(HE×400)

3 討論

糖尿病因代謝紊亂引起血管內皮細胞損傷，內皮介質的異常釋放是內皮細胞損傷和功能紊亂的標志[4、5]。vWF是由內皮細胞合成和分泌的一種糖蛋白，貯存于血管內皮細胞(Weibel-palade)的小體、血小板及血漿中，其主要參與凝血機制和活化血小板的功能[6]。高血糖時可使血管內皮細胞受損，血漿vWF含量升高[7]。vWF是內皮細胞損傷及功能障礙的標志物，在血小板與血管壁的結合中起重要的橋梁作用。當血小板活化時，vWF一端與血小板膜糖蛋白Ib結合，另一端與血管壁纖維連接蛋白及膠原結合，使血小板能牢固地黏附在血管內皮下，血管受損，基底膜膠原暴露，除激活因子xII啟動內原性凝血機制外，內皮細胞還表達并釋放vWF導致血小板在損傷部位黏附聚集形成血栓，阻塞血管腔，造成微循環障礙，使血管內皮功能異常，從而參與糖尿病血管病變的發生和發展[8]。糖化血紅蛋白(HbAIc)可監測血糖長期控制情況，也能反映體內糖代謝情況[9]。是血紅蛋白A組分的某些結構與葡萄糖的非酶促反應結合而形成的產物，體內血糖升高能加速HbA1c的這種生理過程，使血紅蛋白與2，3-二磷酸甘油酸(2，3-DPG)的結合減低，血紅蛋白對氧的親合力增高，氧離曲線左移，造成組織缺氧，致使血管內皮細胞代謝障礙受損而形成糖尿病血管病變[10]。

本實驗結果顯示，隨著血糖的增高，HbA1c逐漸增高，vWF也隨著HbA1c的增高而急劇增高，表明糖尿病血管病變的發生與糖尿病血糖水平的高低呈現明顯的正相關關系，且與相關報道相符[11]。達美康在降低血糖方面療效顯著，而在降低vWF方面卻不及抵當芪桂湯，考慮抵當芪桂湯在降低vWF方面可能還有著多層次的作用靶點。而抵當芪桂湯不同劑量對實驗大鼠有不同程度降低vWF和HbAlc含量的作用，提示中藥的量效關系也是本方進一步研究的重點，其中抵當芪桂湯正常劑量組治療效果優于抵當芪桂湯加達美康組和抵當芪桂湯大劑量組，考慮可能與實驗動物的耐受性有關。

糖尿病是慢性病理過程，可有陰虛熱盛-氣陰兩虛-陰陽兩虛的演變。因久病多虛，久病多瘀，最終導致氣陰兩虛、脈絡瘀阻。糖尿病血管病變是在陰虛熱盛的基礎上發生和演變的，同時伴有脈絡瘀滯。當病邪侵襲脈絡傷及絡氣，使絡氣郁滯導致津血互化障礙，津凝為痰，血滯為瘀，痰瘀阻滯絡脈，血行不暢，從而形成痰瘀阻絡的病理狀態。氣血耗損無以榮養絡脈，致絡虛不榮傷及形質。抵當湯芪桂湯是以張仲景抵當湯、黃芪桂枝五物湯化裁而成，方中生黃芪益氣固表，炒白芍養陰生津為君藥;酒大黃活血化瘀，水蛭化瘀通絡，桂枝溫通經脈為臣藥;鬼箭羽活血化瘀為佐藥，諸藥合用，共奏益氣養陰、化瘀通絡之功，適用于糖尿病及其并發癥屬氣陰兩虛、絡脈瘀阻證。現代藥理研究證實，黃芪在缺糖缺氧的條件下，具有保護細胞的作用，可以調節多種細胞因子的活性;白芍提取物有抗血栓的作用;大黃有降低血糖和糖化血紅蛋白，改善糖代謝的作用;水蛭具有抗凝血、抗血栓的作用;桂枝能增加冠脈血流量，擴張外周血管，改善微循環;鬼箭羽亦有改善血液流變性，降低血糖和調節血脂的作用。

綜上所述，vWF是反應血管內皮功能方面的標志蛋白之一，與HbA1c有著密切的聯系。抵當芪桂湯通過降低vWF及HbA1c含量以改善血管內皮功能，可能是該方防治糖尿病及其并發癥的作用機理之一。

[1]陸再英，鐘南山主編.內科學(第7版)[M].北京:人民出版社，2008.770.

[3]孫敬方.動物實驗方法學[M].北京:人民衛生出版社，2004.478.

[4]彭麗，顧明君.血管內皮功能異常的評價方法[J].上海醫學雜志，2007，30(12):946-948.

[5]Thorand B，Baumert J，Chambless L，et al.Elevated markers of endothelial dysfunction predict type 2 diabetes mellitus in middleaged men and women from the generalpopulation[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol，2006，26(2):398-405.

[6]崔紅艷，王芳.2型糖尿病中內皮細胞損傷及血小板功能狀態的改變[J].河南大學學報(醫學版)，2009，28(1):59.

[7]方朝暉，章紅，倪英群.益氣養陰活血法對2型糖尿病患者血栓前狀態血管內皮損傷的干預研究[J].中國全科醫學，2009，12(2B):272-274.

[8]王保嵐，張曼華.血管性假血友病因子、血栓調節蛋白與糖尿病腎病的關系研究[J].醫學綜述，2008，14(5):731-733.

[9]楊光，王麗波，王德才.2型糖尿病患者糖代謝與胰島B細胞功能關系[J].中國公共衛生，2009，25(4):404-405.

[10]石淑春，彭莉萍，莫殿軍，等.糖化血紅蛋白、血脂、尿微量蛋白與糖尿病腎病的關系[J].檢驗醫學與臨床，2005，2(2):56-57.

[11]錢建忠，魏麗.血管性血友病因子在2型糖尿病血管并發癥中的意義[J].江蘇大學學報(醫學版)，2008，18(5):444-445.