補腎與健脾方對骨質疏松癥大鼠干預作用及下丘腦PKC蛋白表達的影響*

孫 鑫，鄭洪新，燕 燕，王思程，尚德陽，鄧洋洋，李 楠

(遼寧中醫藥大學，遼寧沈陽 110032)

骨質疏松癥(Osteoporosis OP)是以骨量減少、骨組織微細結構破壞為特征，繼而導致骨脆性增加和骨折危險性增高的一種全身性骨骼疾病[1]。本病發病機制尚未闡明，其發生與諸多因素有關。

蛋白激酶C(PKC)是1977年在鼠腦的胞質成分中發現的一種依賴磷脂和鈣的蛋白激酶，由多種同工酶亞型組成，屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶家族成員之一，以其活性依賴于Ca2+而得名，參與多種生命活動，如蛋白磷酸化、信號傳遞、細胞增殖和分裂、跨膜離子轉運、平滑肌收縮、基因表達等[2]。本實驗選取PKCα與PKCβ2作為研究對象，應用補腎益髓中藥對模型大鼠進行干預，旨在探索骨質疏松癥的發病機制以及補腎益髓中藥的防治作用。

1 材料

1.1 動物

清潔級雌性4～5月齡wistar大鼠，169只，體重230g～270g，由中國醫學科學院實驗動物中心提供。

1.2 藥物

實驗藥品:補腎壯骨益髓中藥(牡蠣、鹿茸等);對照藥品:骨疏康顆粒劑(遼寧康辰藥業有限公司);蓋天力片(東盛科技啟東蓋天力制藥股份有限公司);健脾中藥(補中益氣湯方由遼寧中醫藥大學附屬醫院藥房提供)。

1.3 試劑

兔抗 PKCα-抗 (Santa Cruz)、兔抗 PKCβ2-抗(Santa Cruz)、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(北京中山生物公司)、堿性磷酸酶(ALP)偶聯的羊抗兔抗體(北京中山生物公司)。

2 方法

2.1 動物分組

1組:正常組;2組:假手術組;3組:模型空白組(模空組);4組:補腎中藥低劑量組(低劑量組);5組:補腎中藥高劑量組(高劑量組);6組:補中益氣湯對照組(健脾組);7組:蓋天力鈣片對照組(蓋天力組);8組:骨疏康顆粒對照組(骨疏康組)。

2.2 造模方法

手術摘除大鼠雙側卵巢的方法(去勢法)造骨質疏松癥模型。假手術組大鼠只切開皮膚及皮下組織，暴露雙側卵巢但不摘除。正常組不手術。

2.3 飼養方法

正常組及假手術組大鼠正常飲食不灌胃，其他各組大鼠正常飲食并給予相應藥物灌胃，每日1次，共3個月。藥物劑量:大鼠等效劑量按成人每日用藥量的6.3倍計算，容積為0.875ml/100g體重。

2.4 取材

實驗大鼠在最后1次灌胃后，禁食24h后取材。大鼠經10%水合氯醛注射麻醉(0.3ml/100g體重)后用碘伏消毒手術部位，采集標本。本實驗保留標本包括下丘腦(置高壓滅菌EP管內－70℃保存)、左后肢股骨(置塑料保鮮袋內－70℃冰箱凍存)、子宮(稱取濕重)。

2.5 統計方法

3 結果

3.1 動物模型評價

3.1.1 骨密度 通過雙能X線骨密度分析儀(附帶“The Small Subject Scout Scan”軟件)對大鼠離體股骨進行檢測(掃描寬度15cm，長度可任意調節，掃描速度40mm/s，分辨率為1.0×1.0mm;結果采用單位面積內的骨礦物質含量(g/cm2)表示)，所得結果如下:與正常組比較，模空組大鼠股骨頭骨密度顯著降低(P<0.01);與模型空白組比較，補腎中藥高劑量組可顯著增加骨密度(P<0.01)，而健脾中藥作用不明顯，與補腎中藥高劑量組差異顯著(P<0.01)。

3.1.2 子宮指數 實驗大鼠子宮指數統計結果顯示，與正常組、假手術組相比較，模空組子宮指數明顯降低(P<0.01)。

表1 各組大鼠左后肢離體股骨骨密度比較(s)

表1 各組大鼠左后肢離體股骨骨密度比較(s)

注:與正常組比較:*P<0.05;與正常組比較:**P<0.01;與模空組比較:#P<0.05，與模空組比較:##P<0.01;與低劑量比較:●P<0.05;與低劑量比較:●●P<0.01;與高劑量比較:☆P<0.05，與高劑量比較:☆☆P<0.01

組別 n 全股骨骨密度(g/cm2)正 常 組 15 0.16433±0.01466##假 手 術 組 17 0.15582±0.01138##模 空 組 21 0.14700 ±0.01035**低 劑 量 組 21 0.15186 ±0.01285**☆高 劑 量 組 21 0.16095±0.01593##●健 脾 組 19 0.14211 ±0.01127**●☆☆骨 疏 康 組 20 0.14835 ±0.01483**☆☆蓋 天 力 組 20 0.15695±0.00778#

表2 各組藥物對腎虛骨質疏松大鼠子宮指數影響的比較(s)

表2 各組藥物對腎虛骨質疏松大鼠子宮指數影響的比較(s)

注:同表1～1

組別n子宮指數(s)正 常 組 15 2.0434±0.7178##假 手 術 組 17 1.8195±0.4311##模 空 組 21 0.2859 ±0.0469**低 劑 量 組 21 0.2930 ±0.0501**高 劑 量 組 21 0.3110 ±0.0694**健 脾 組 19 0.2773 ±0.0435**骨 疏 康 組 20 0.2835 ±0.0170**蓋 天 力 組 20 0.2888±0.0684**

3.1.3 大鼠行為學指標 正常組大鼠皮毛光澤，活潑喜動，反應靈敏，食欲佳，無豎毛、弓背、聚堆等表現。模空組大鼠均出現弓背塌腰表現，其他表現如毛色變淡、蜷縮、聚堆、反應遲鈍、喜靜懶動、抗應激能力下降等癥狀不十分明顯，各劑量補腎中藥組及陽性對照組的弓背塌腰表現較模空組為輕。用藥各組弓背塌腰癥狀改善率為:低劑量組33.3%，高劑量組52.4%，健脾組15.8%，蓋天力組30%，骨疏康組25%。

從以上結果分析，本次實驗骨質疏松癥大鼠模型造模成功，且以弓背塌腰癥狀為腎虛模型的表征信息，補腎各組優于健脾組。

3.2 下丘腦組織中PKCα、PKCβ2蛋白表達

3.2.1 檢測方法 Western blotting法檢測大鼠下丘腦組織中PKCα、PKCβ2蛋白表達。經Scion Image軟件進行灰度值測量后進行統計分析。

圖1 大鼠下丘腦組織中PKCα Western blotting結果

3.2.2 實驗結果 大鼠下丘腦組織中PKCα、PKCβ2的蛋白表達結果顯示，與正常組相比，模空組顯著增高(P<0.01);與模空組相比，低劑量組、高劑量組、健脾組、蓋天力組、骨疏康組均有顯著降低(P<0.01);與低劑量組相比，高劑量組、健脾組、蓋天力組、骨疏康組有顯著差異(P<0.01)。補腎各組與補脾組蛋白表達較模空組降低，趨近正常組，均有改善作用，但補腎中藥優于健脾中藥。

圖2 大鼠下丘腦組織中PKCβ2Western blotting結果

表3 大鼠下丘腦組織中PKCα、β2 Western blotting結果對比(s，n=6)

表3 大鼠下丘腦組織中PKCα、β2 Western blotting結果對比(s，n=6)

注:同表1～1

組 別 PKCα的蛋白表達 PKCβ2的蛋白表達正 常 組 27.88857± 2.545057##☆☆ 24.58286±1.809399##☆☆假 手 術 組 33.15586± 2.690432##☆☆ 26.24429±1.603588##☆☆模 空 組 158.55000±18.89263**☆☆ 146.6129±7.179045**☆☆低 劑 量 組 47.48000± 4.364485##☆☆ 25.35429±1.912711##☆☆高 劑 量 組 32.88857± 2.89289##**●● 14.08429 ±1.139735##**●●健 脾 組 25.24000± 2.321472##**●● 13.73429±0.960917##**●●骨 疏 康 組 22.71286± 1.832109##**●●☆☆ 3.67571±0.611742##**●●☆☆蓋 天 力 組 26.37571± 2.204373##**●● 12.69714±1.078884##**●●

4 討論

4.1 骨質疏松癥動物模型的選擇

大鼠分布廣，繁殖快，生命周期短，便于飼養，費用較低，是目前研究骨質疏松使用最多、最成熟的造模動物。Wistar大鼠具有對傳染病抵抗力較強、自發性腫瘤發生率低等特點，十分適合用來進行與老年性疾病相關的實驗。骨質疏松的模型也較多，包括去勢骨質疏松癥模型、老年性骨質疏松動物模型、維甲酸致骨質疏松模型、尾部懸吊模型等。本實驗采用的去勢骨質疏松癥模型是一種比較成熟的模型，其作用因素單一，模型確認好，重復性好，實驗結果可信度高，適用范圍廣，具有方便性、關聯性、適應性3個特點，能很好地模擬絕經后所表現出來的骨量丟失與骨結構的一系列變化。美國國立衛生研究院、世界衛生組織都推薦用此模型作為研究骨質疏松的最佳模型。當然模型還存在一定的局限性，如單純卵巢切除，無法完全模擬人類女性絕經前后的復雜情況，與臨床實際情況有所差異。

在本實驗中用該模型來模擬女性由于雌激素缺乏而引起的骨質疏松癥，與《素問·上古天真論》中“天癸竭，地道不通，形壞而無子”的描述相符，由于腎中精氣衰竭、月經閉絕，而使骨枯髓減導致“骨痿”。中醫通過外在表現判斷臟腑的變化，又可以“藥”驗“證”，通過觀察去卵巢動物模型術后早期階段如弓背塌腰等一系列的表現，發現其存在典型的腎虛癥狀，應用補腎中藥后這些癥狀緩解或消失，由此證明此模型屬腎虛。

4.2 骨質疏松癥與腎、腦的關系

中醫認為腎主骨，骨病首責于腎，而腎與腦的關系十分密切。“腎藏精，精生髓，髓生骨，故骨者腎之所合也;髓者，腎精所生，精足則髓足，髓在骨內，髓足者則骨強”(《中西匯通醫經精義·臟腑所合》清·唐宗海)，十分精辟地總結了腎、腦、骨這三者的關系。腎虛的機制是復雜的，有觀點認為腎虛可能與“下丘腦-垂體-性腺軸”功能的減退有關。現代醫學對本病的研究也表明，本病的發生是各系統綜合作用的結果，神經內分泌系統是研究的方向之一，并已有相關的研究。結果表明，骨質疏松癥大鼠下丘腦組織中一些因子的變化與本病具有一定的相關性。基于以上原因，本實驗選取下丘腦進行研究。

4.3 PKC與骨質疏松癥的研究

1997年崔家鵬等對腎虛骨質疏松癥大鼠紅細胞膜PKC的活性進行了研究。結果表明，腎虛骨質疏松癥模型大鼠紅細胞膜PKC的活性明顯降低，經密骨靈治療模型大鼠與正常組接近[3]。2003年谷野等進行的體外實驗表明，含密骨顆粒劑的血清可使UMR106成骨樣細胞中的PKC活性增強，且主要以cPKCβ為主，并能促進成骨樣細胞的增殖。成骨細胞是骨代謝過程中的重要細胞，其增殖有利于骨的形成[4]。

4.4 本實驗研究結果的討論

在本次實驗中，補腎中藥的實驗結果接近正常組，其他用藥組與正常組存在顯著差異。補腎中藥防治骨質疏松的效果優于健脾中藥，一方面說明補腎中藥的有效性，另一方面根據中醫以藥驗證的理論說明本實驗骨質疏松動物模型屬腎虛證。

在實驗中，大鼠下丘腦中PKCα與PKCβ2蛋白表達的變化明顯，模空組大鼠與正常組大鼠存在顯著差異，說明骨質疏松癥的發生可能與下丘腦中蛋白激酶的變化密切相關，而PKC的變化可能是其中的一個重要環節。補腎、健脾中藥均可調節下丘腦中PKCα與PKCβ2蛋白表達，且補腎中藥優于健脾中藥，說明PKC的變化可能與多方面因素相關。另外，PKC的變化也有可能是腎虛發生的生物學機制之一，但本次實驗未能進一步研究其具體作用的過程，有待在今后的研究中深入探討。

[1]劉忠厚.骨質疏松學[M].北京:科學出版社，1998.142.

[2]陳敏，唐建武.PKC亞型的生物學特性與調節功能[J].國外醫學·生理病理科學與臨床分冊，2002，22(5):493-496.

[3]谷野，鄭洪新.含密骨顆粒劑血清對UMR106成骨樣細胞增殖及PKC活性的影響[J].遼寧中醫雜志，2003，30(7):575-577.

[4]崔家鵬，鄭洪新，劉景峰，等.補腎中藥對腎虛骨質疏松癥大鼠紅細胞膜PKC、Ca2+-Mg2+ATP酶活性影響的實驗研究[J].中國骨質疏松雜志，1997，3(3):66-69.