商陸對阿霉素腎病腎小球胞外基質影響的實驗研究

李 明，張克非，楊亦彬

（遵義醫學院附屬醫院腎內科，貴州遵義563000）

細胞外基質（extracellular matrix,ECM）在腎小球內過度蓄積，是腎小球硬化的主要病理特征性變化，且其成分過度蓄積可加速硬化進程，因此減少基質過度蓄積，也是臨床治療腎小球硬化的重點[1]。商陸（pokeberry root）是傳統的瀉下利水藥，動物實驗研究表明商陸對腎功能有一定保護作用[2,3]。本研究旨在觀察商陸水煎劑是否可減輕ECM蓄積，為其防治腎小球硬化提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SD雄性大鼠50只，三月齡，體重200±20g，第三軍醫大學野戰外科研究所提供，合格證號（scxk渝20020003）。

1.2 試劑及藥品 小鼠抗MMP-2單克隆抗體（批號：567P608C），小鼠抗FN單克隆抗體（批號：1351P11E），兔抗LN多克隆抗體（批號：082A511C），均購自NEOMARKERS公司；阿霉素（10mg/支，批號0411E1，深圳萬樂藥業有限公司）；商陸水煎劑：貴州本地產野生商陸飲片，按商陸/醋=10/3的比例制成醋炙品，干燥備用（含30%的醋煮商陸毒性最小）[4]，用時按中藥常規方法煎煮。

1.3 實驗方法

1.3.1 分組 SD大鼠隨機分為：①對照組10只；②模型組10只；③模型治療組，包括商陸組、依那普利組各10只。

1.3.2 制模方法 參照文獻[5]：1.5%戊巴比妥納50mg/kg腹腔注射麻醉，常規消毒在無菌條件下背部切口1～1.5cm，暴露左腎，剝離腎臟脂肪及腎上腺，結扎左腎門血管，切除左腎并縫合切口。術后第1周予阿霉素4mg/kg尾靜脈注射，第4周再次注射3mg/kg。對照組：分離左腎臟脂肪包膜，不切除左腎并縫合切口，術后第1周尾靜脈注射生理鹽水0.5mL，4wk后等量重復注射。

1.3.3 治療方法 商陸組、依那普利組分別于成模1wk后給予商陸水煎劑4000mg/kg.d、依那普利混懸液4mg/kg.d灌胃，對照組、模型組分別給予等量生理鹽水灌胃，每日一次，自由飲食。14wk后將大鼠麻醉處死，取腎臟標本石蠟包埋。

1.4 腎組織病理學檢查方法

1.4.1 ECM相對面積 每張PASM染色切片在40倍物鏡下隨機取20個完整且不重復腎小球，采集腎小球基質著色區，計算腎小球基質面積/腎小球面積比，取均值(Leica分析系統)。

1.4.2 免疫組織化學染色 采用SABC法，實驗嚴格按說明書進行。每張切片在40倍物鏡隨機取20個完整且不重復的腎小球,Leica分析系統分析，計算腎小球陽性目標面積/腎小球面積，取均值。

2 結果

2.1 ECM相對面積 模型組腎小球系膜區增寬，系膜基質中度至重度增生并呈彌漫性分布，商陸組和依那普利組腎小球系膜基質增生程度較模型組明顯減輕，其腎小球ECM相對面積均低于模型組 (P<0.05)，二者間無統計學差異(P﹥0.05)，見表 1。

2.2 免疫組化結果 與模型組比較，商陸組、依那普利組FN、LN腎小球陽性著染面積明顯減少（P<0.05），二者無統計學差異（P＞0.05）；商陸組、依那普利組MMP-2在腎小球陽性著染面積明顯高于模型組(P<0.05)，商陸組低于依那普利組(P<0.05)，見表2和圖1。

圖1 FN、LN、MMP-2免疫組化結果

表1 各組大鼠腎小球ECM相對面積比較（s）

表1 各組大鼠腎小球ECM相對面積比較（s）

注：與對照組比較，▲P<0.05；與模型組比較，△P<0.05。

組別 n ECM(%)正常對照組 10 4.31±1.85模型組 10 13.33±2.24▲商陸組 10 7.83±2.60▲△依那普利組 10 6.06±2.02△

表2 各組大鼠腎小球LN、FN和MMP-2相對陽性面積（s）

表2 各組大鼠腎小球LN、FN和MMP-2相對陽性面積（s）

注：與對照組比較，▲P<0.05；與模型組比較，△P<0.05；與依那普利組比較，◆P<0.05。

組別 n FN（%）LN(%)MMP-2(%)正常對照組 10 4.20±1.33 5.21±1.92 39.13±6.52模型組 10 18.36±4.54▲ 20.58±5.74▲ 15.05±4.56▲商陸組 10 8.35±2.69▲△ 10.76±2.98▲△ 27.31±4.88▲△◆依那普利組 10 8.07±2.61▲△ 9.06±4.01▲△ 36.11±3.77△

3 討論

慢性腎臟病腎小球系膜細胞的增殖及細胞外基質(ECM)的大量堆積是腎小球進展性硬化的兩個顯著的特征，ECM除促進各種炎性細胞的遷移聚集和增殖，加速硬化進程外，還可調節系膜細胞向成纖維細胞轉化，促進硬化進展[1]。ECM積蓄由ECM的合成和降解兩方面決定，層粘連蛋白（LN）、纖連蛋白（FN）等是ECM的主要成分，而基質金屬蛋白酶-2（MMP-2）是腎臟主要的基質降解酶，在腎臟發生病變時,細胞外基質的正常組成成分可異常表達，而基質降解系統的降解功能亦減退。

單側腎臟切除加重復注射阿霉素造模被認為是研究系膜增生性腎炎向腎小球硬化轉化進程中的一個組間差異小，穩定性和重復性好的實驗動物模型[5]。本實驗病理檢查示模型組腎小球ECM相對面積明顯高于對照組（P<0.01），系膜基質中度至重度增生并呈彌漫性分布，毛細血管開放不良，部分腎小球呈局灶節段硬化，與文獻報道一致[5]。

慢性腎臟病時因細胞因子、免疫介導、炎癥損傷、氧化應激、血流動力學紊亂等可直接或間接導致ECM成分改變。本實驗顯示模型組腎小球FN、LN表達上調，MMP-2下調，而商陸水煎劑灌胃處理模型大鼠腎小球ECM相對面積較模型組明顯減少 (P<0.05)，腎小球 FN、LN 表達降低（P﹤0.05），MMP-2 表達增強（P﹤0.05），提示商陸水煎劑具有下調腎小球LN、FN表達、上調腎小球MMP-2表達、減少ECM過度蓄積。商陸是傳統的瀉下利水藥，現代醫學研究證明商陸對免疫系統有重要調節作用，其在慢性腎臟病中的治療作用也日益受到重視。研究表明商陸可抑制TNF、NO、IL-1、IL-2等炎癥介質釋放，抑制中性粒細胞、內皮細胞的黏附，顯著降低ICAM-1和CD18表達[6,7]，商陸提取物可抑制高糖引起的系膜細胞增殖，減少TGF-β產生[8]，降低實驗性糖尿病和系膜增生性腎炎大鼠尿蛋白排泄[2,3]，這些研究結果提示商陸可能通過多種途徑調控ECM積蓄。

許多研究已證實ACEI具有較好的減輕ECM蓄積作用[9]。本實驗結果顯示商陸組在降低ECM相對面積和下調LN、FN的表達與依那普利組無明顯差異(P﹥0.05)，但上調腎小球MM-2卻低于依那普利（P﹤0.05）,是商陸降低ECM蓄積不如ACEI類藥物還是實驗技術原因有待進一步研究。

[1]Jarvelainen H,Sainio A,Koulo M,et al.Extracellular matrix molecules:potential targets in pharmacotherapy[J].Pharmacol Rev,2009,61(2):198–223.

[2]Jeong SI,Kim KJ,Choi MK，et al.Alpha-spinasterol isolated from the root of phytolacca americana and its pharmacologicalproperty on diabetic nephropathy[J].Planta Med,2004,70(8):736-739.

[3]張克非，張亮，吳雄飛.商陸皂苷甲治療大鼠抗-Thy1.1系膜增生性腎炎的實驗研究[J].四川大學學報（醫學版），2004,35(5):662-664.

[4]金傳山，張京生.不同醋量對商陸毒性及藥效的影響[J].中成藥,2000,22（4）：273-274.

[5]李榮山.現在腎臟病實驗技術[M].軍事醫學科學出版社,2006.70-72.

[6]Xiao Z Y,Zheng Q Y.Effect of esculentoside a on production of interleukin-1、2、and prostaglandin E2 [J].Acta Pharmacol Sin,2004,25(6):817-821.

[7]肖振宇,張俊平,陸峰,等.商陸皂苷甲對細胞間黏附的影響[J].藥學學報，2003,38（10）：728-730.

[8]Jeong SI,Kim KJ,Choo YK,et al.Phytolacca americana inhibits the high glucose-induced mesangial proliferation via suppressing extracellular matrix accumulation and TGF-beta production[J].Phytomedicine,2004,11(2-3):175-181.

[9]Naito T,Ma LJ,Yang H,et al.Angiotensin type 2 receptor actions contribute to angiotensin type 1 receptor blocker effects on kidney fibrosis[J].Am J Physiol Renal Physiol，2010,298(3):683–691.