富血小板血漿對人牙周膜成纖維細胞在脫礦病變牙根表面增殖及分化的影響

高 麗 ，馬葉華 ，何權(quán)敏 ，張 劍 ，劉 琪

（1.遵義醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院口腔內(nèi)科，貴州遵義563003；2.江蘇省宜興市牙病防治所，江蘇宜興214200）

牙周組織再生需要形成新附著，而新附著的形成是一個復(fù)雜的過程，它包括了牙周組織細胞和胞外基質(zhì)在時間和空間上的協(xié)作[1]，涉及牙周組織細胞的遷移、附著及增殖；而新附著形成的首要條件是PDLFs在牙骨質(zhì)表面的附著與增殖，在這一過程中起主要調(diào)控作用的是細胞因子和生長因子[2]。PRP是血液經(jīng)離心后獲得的含有較豐富的生長因子，其中以TGF-β和PDGF所占比例最大，而且，自體PRP克服了免疫原性和傳染疾病的可能性。且體外實驗結(jié)果顯示，PRP可以促進牙周細胞在病變牙根表面的附著、增殖及細胞外基質(zhì)膠原的形成[3,4]，本實驗旨在研究不同濃度PRP在不同時間內(nèi)對人牙周膜成纖維細胞在脫礦的病變牙根表面附著、增殖及對堿性磷酸酶活性的影響的情況，以進一步闡明PRP促進牙周組織再生的機制，為將PRP應(yīng)用于臨床奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 新鮮全血（遵義醫(yī)學(xué)院中心血庫）、標準胎牛血清（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所）、DMEM 培養(yǎng)基 （SIGMA,USA）、CO2培養(yǎng)箱（Shel Lab，USA）、潔凈工作臺（北京冠鵬凈化設(shè)備有限公司）、倒置相差顯微鏡及照相系統(tǒng)（Olympus，JAPAN）、Centrifuge 5804R高速冷凍離心機（eppendorf，Germany）、Sysmex KX－21N 全自動血液分析儀（Germany）、噻唑鹽(Biomol,USA)、對硝基磷酸二鈉（p-Nitrophenyl Phosphate Disodium,pNPP,Sigma,美國）48孔板和96孔板(Becton Dickinsen Labware)、酶聯(lián)免疫檢測儀（BIO-TEK INSTRUMENTS.INC）。

1.2 實驗方法

1.2.1 hPDLFs的體外培養(yǎng)鑒定 采用組織塊法培養(yǎng)進行原代培養(yǎng)，選取因正畸需要、年齡在12至15歲之間、新鮮拔除的健康前磨牙，刮取根中1/3牙周膜組織，剪成1mm3大小，平鋪于25mL培養(yǎng)瓶瓶底，加入2mL DMEM培養(yǎng)液（為含25%胎牛血清，100U/mL青霉素，100U/mL鏈霉素置于飽和濕度、5%CO2、95%空氣、37℃的標準壞境下）中培養(yǎng)，倒置相差顯微鏡下觀察細胞的生長狀況，待細胞長滿瓶底的85%時加入預(yù)熱至37℃的0.25%胰蛋白酶消化并進行傳代，取第5代細胞用于實驗,實驗前利用免疫組化ABC法進行細胞胞漿波形絲蛋白和角蛋白染色，作細胞來源鑒定。

1.2.2 hPDLFs的形態(tài)學(xué)觀察 從原代開始逐日在倒置相差顯微鏡下觀察hPDLFs形態(tài)變化特征、生長狀況并照相。

1.2.3 牙根片的制備 取因重度牙周炎拔除的患牙（納入標準：牙周探診深度>5mm,附著喪失>5mm，X線片顯示牙槽骨吸收至少達根尖1/3，患者年齡40歲至65歲，無全身系統(tǒng)性疾病，牙周基礎(chǔ)治療史，根面無齲壞及充填物），用刮治器輕輕刮凈附在根面上的軟組織，取根中1/3段，在冷水冷卻的條件下用金剛砂片磨成4mm x 4mm大小、lmm厚(只磨除牙本質(zhì)側(cè)，牙骨質(zhì)側(cè)不磨)的根片，以240g/L的EDTA脫礦處理2min，將收集的根片高壓后放入DMEM培養(yǎng)液中浸泡48h后待用。

1.2.4 富血小板血漿（PRP）的制備 采用GONSHOR[5]的方法。富血小板血漿的制作全過程嚴格無菌，取新鮮全血（已加入抗凝劑），經(jīng)兩次離心法提取PRP，第一次離心（1300 r/min）10min，吸取全部上清液及交界面以下1～2mm的紅細胞至另一離心管，棄去下層紅細胞，再次離心（2000 r/min）10min，可見管底部有白色沉淀，摻雜少許紅細胞，上層液體清亮，緩緩吸出上層液體，留2～4mL液體與底部沉淀，將上層液體與沉淀用吸管吹打均勻，所得混合液即為PRP。將所取的PRP一部分收集于EP管，貯存在-20℃環(huán)境下備用。另一部分PRP與10%的氯化鈣及牛凝血酶以體積比9：1混合，4℃冰箱過夜，待血凝塊收縮后，低溫下，再次離心（10000r/min）10min，吸取上清液于EP管，0.22μm微膜過濾后，貯存于-20℃環(huán)境下備用。

1.2.5 不同濃度PRP在不同時間內(nèi)對hPDLFs在脫礦的病變牙根表面增殖的影響

1.2.5.1 實驗分組 設(shè)對照組與實驗組，對照組為含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液，實驗組分別為含10%PRP、15%PRP、20%PRP、30%PRP 的 DMEM 培養(yǎng)液，每組設(shè)5個復(fù)孔。

1.2.5.2 24h內(nèi)不同濃度PRP對hPDLFs在脫礦的病變牙根表面增殖的影響 將脫礦處理的根片用雙面膠固定在96孔板底部，放入超凈臺中紫外線光照2h。實驗各組根片包被5μl PRP，自然干燥，紫外光照30min，取生長良好的第五代hPDLFs，更換為無血清的DMEM培養(yǎng)液中，CO2孵箱內(nèi)標準環(huán)境下培養(yǎng)24h，使細胞相對同步化，用0.25%的胰蛋白酶消化3min左右，棄去消化液，加入含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液3mL，反復(fù)吹打，制成單細胞懸液計數(shù)，調(diào)整細胞濃度為2×105，取100μL接種至已加入牙根片的96孔培養(yǎng)板，待細胞貼壁后棄上清液，按實驗分組分別加入含不同濃度PRP培養(yǎng)液，標準環(huán)境下孵育24h后，每孔加20μl的CCK-8,繼續(xù)孵育4h，用酶聯(lián)免疫檢測儀在450nm波長下檢測各孔OD值，每組設(shè)5個復(fù)孔。

1.2.5.3 不同時間內(nèi)PRP對hPDLFs在脫礦的病變牙根表面增殖的影響 同上方法取最佳濃度組，以含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液為對照組，調(diào)整細胞濃度為1.5×104，每48小時更換培養(yǎng)液一次，觀察1wk內(nèi)人hPDLFs增殖的情況。每孔設(shè)5個復(fù)孔。

1.2.5.4 24h內(nèi)PRP對hPDLFs ALP活性影響的測定 同1.2.5.2方法,取不同濃度的PRP培養(yǎng)細胞24h后,棄培養(yǎng)液,加入 100μL的 0.2%Triton X-100裂解細胞，再加入100μl標準pNPP底物液，37℃孵育30min，以NaOH終止反應(yīng)；用酶聯(lián)免疫檢測儀在405nm波長下檢測各孔及空白對照孔OD值。每孔設(shè)3個復(fù)孔；標準ALP為陽性對照，經(jīng)系列稀釋后得出標準曲線，計算ALP活性（U/mg蛋白）。

2 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS13.0軟件對所有數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，同一時間點的各組數(shù)據(jù)之間采用單因素方差分析（one-way analysis of variance,ANOVA），同一組的不同時間點之間采用配對t檢驗；P<0.05表示有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 hPDLFs的生物學(xué)特征 倒置顯微鏡下觀察，原代細胞約7d從組織塊周圍游出，呈放射狀生長。細胞呈長梭形，胞漿突2到4個，胞體豐滿，胞漿均勻，胞核橢圓形（圖1，圖2）。免疫組化染色表明該細胞波形絲蛋白染色陽性，角蛋白染色陰性，證實為中胚層來源的細胞，加之取材部位，可以肯定所培養(yǎng)的細胞為hPDLFs。

3.2 24h不同濃度PRP對hPDLFs在脫礦的病變牙根表面增殖的影響結(jié)果見表1，24h時各濃度PRP組細胞量均高于對照組（P<0.05），其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義；隨著PRP濃度的增加，細胞增殖亦隨之增加，當PRP濃度達到20%時，細胞增殖效應(yīng)達到最佳，而隨著PRP濃度的繼續(xù)增加，細胞增殖效應(yīng)呈下降趨勢。

3.3 不同時間內(nèi)20%PRP對hPDLFs在脫礦病變牙根表面增殖的影響 結(jié)果見表2，在同一時間點，20%PRP組的細胞量均高于對照組；20%PRP隨著與細胞作用時間的增加，其促進細胞增殖的作用亦愈強，當20%PRP與細胞作用時間達6d時，其增殖效應(yīng)達到最佳。

圖1 原代細胞在組織塊周圍呈放射狀生長×100

圖2 第五代細胞細胞呈長梭形×100

3.4 24h內(nèi)不同濃度PRP對hPDLFs ALP活性的影響 結(jié)果見表3，各種濃度的PRP組中人牙周膜成纖維細胞的堿性磷酸酶活性均高于對照組（P<0.05），且與PRP濃度成正比，其中以20%PRP組的hPDLFs堿性磷酸酶活性最高（P<0.05）。

表1 24h不同濃度PRP對hPDLFs在脫礦的病變牙根表面增殖的影響（s，n=5）

表1 24h不同濃度PRP對hPDLFs在脫礦的病變牙根表面增殖的影響（s，n=5）

*表示與對照組相比P<0.05，△表示實驗組各組之間比較P<0.05

group（n=5）OD 值（s）10%FBS 0.4374±0.1492 10%PRP 0.5007±0.0638*△15%PRP 0.5504±0.0630*△20%PRP 0.6029±0.0706*△30%PRP 0.6002±0.2963*

表2 不同時間內(nèi)20%PRP對hPDLFs在脫礦病變牙根表面增殖的影響（s，n=5）

表2 不同時間內(nèi)20%PRP對hPDLFs在脫礦病變牙根表面增殖的影響（s，n=5）

注：同一時間點時，F(xiàn)BS與PRP比較，*表示P<0.05；PRP組在不同時間點與第6天比較，△表示P<0.05

細胞量10%FBS 20%PRP 1 0.2942±0.0258 0.39±0.0058△*2 0.3120±0.0447 0.44±0.0148△*3 0.3524±0.0230 0.47±0.0286△*4 0.4126±0.0336 0.52±0.0158△*5 0.4438±0.0319 0.57±0.0364△*6 0.4754±0.0610 0.62±0.0258*7 0.4616±0.0680 0.62±0.0594*時間（天）

表3 不同濃度PRP對hPDLFs ALP活性的影響（s，n=3）

表3 不同濃度PRP對hPDLFs ALP活性的影響（s，n=3）

注：與DMEM組比較，*表示P<0.05；各濃度PRP組與20%PRP組比較，△表示P<0.05

ALP活性DMEM 76.440±1.736 10%PRP 110.966±4.545*△15%PRP 136.560±1.759*△20%PRP 166.332±2.196*30%PRP 166.870±4.191*

4 討論

研究表明，牙周病在通過有效治療后，牙周膜成纖維細胞應(yīng)首先附著于牙骨質(zhì)表面，才能實現(xiàn)牙周組織的新生及牙周新附著的形成[3]。因此如何促進牙周膜成纖維細胞附著于病變牙根面已成為眾多學(xué)者的研究熱點，其中生長因子對牙周組織新附著的形成是目前關(guān)注的熱點之一。

在牙周組織再生中,生長因子能促進牙周組織細胞的附著、增殖、趨化及細胞外基質(zhì)的形成[6，7]，Parkar[8]等的研究結(jié)果顯示再生牙周組織中血小板衍化生長因子（PDGF）和轉(zhuǎn)化生長因子（TGF-β）受體均有較強表達。已有的研究證實PDGF對遷移到愈合創(chuàng)面的細胞具有有絲分裂作用[9]，PDGF趨化這些細胞到達創(chuàng)面后，進一步促使其分化、增殖，從而加速創(chuàng)傷的愈合。Cho[9]等的研究結(jié)果表明PDGF在牙周組織創(chuàng)口愈合早期可促使新分化的PDLFs沿牙根面遷移，這不僅能促進牙周組織的再生，還能避免牙根與牙槽骨粘連在一起，并可避免牙根吸收。Oates和Dennison等[10，11]研究了TGF-β對牙周膜成纖維細胞的影響，表明人牙周膜成纖維細胞的增殖與TGF-β呈劑量依賴性和時間依賴性。但是，實驗研究中所應(yīng)用的多是外源性生長因子，單一或兩種生長因子，與體內(nèi)實際情況相差較大，且外源性生長因子與機體的相容性尚不清楚，不同類型生長因子的最佳配伍及最適濃度都有待于進一步研究。

自體PRP是血液通過離心后獲得的血小板濃縮物，它克服了免疫原性和傳染疾病的可能性，其中含有較豐富的生長因子，有研究認為PRP中含有的生長因子濃度達到外周血血小板濃度的3倍以上[8]，其中TGF-β和PDGF所占比例最大；PRP不但能促進牙周細胞在病變牙根表面的附著、增殖，而且還能促進牙周細胞的增殖和細胞外基質(zhì)膠原的形成，更接近體內(nèi)的實際情況[5]。

本實驗觀察不同濃度PRP在不同時間對hPDL Fs的影響，在同一時間內(nèi)，在10%～20%的濃度范圍內(nèi)，PRP對hPDLFs在病變牙根表面的附著、增殖及對堿性磷酸酶活性的影響呈濃度依賴性，當PRP濃度為30%時，細胞增殖與附著有下降趨勢，由此推測當PRP濃度為20%左右時，對hPDLFs在病變牙根表面的附著、增殖及對堿性磷酸酶活性的影響效果達到最佳。這與國內(nèi)學(xué)者林敏魁[12]等研究結(jié)果基本一致；分析其可能原因為經(jīng)PRP包被，PRP首先在牙根表面形成PRP膜，有利于細胞最初的募集和附著，從而更有利于PDLFs在病變牙根表面附著和增殖。在不同時間內(nèi)，20%PRP對hPDLFs在病變牙根表面的附著與增殖呈時間依賴性，第6天達到最佳，第7天則細胞附著與增殖不明顯（P>0.05）,推測20%PRP作用于hPDLFs 6d，能促進牙周膜成纖維細胞在病變牙根表面附著,從而為促牙周再生的臨床應(yīng)用提供理論和實驗依據(jù)。

[1]Lackler KP,Cochran DL,Hoang AM,et al.Development of an in vitro wound healing model for periodontal cells[J].J Periodontol,2000,71(2):226-237.

[2]Rincon JC,Haase HR,Bartold PM.Effect of Emdogain on human periodontal fibroblasts in an in vitro woundhealing model[J].J Periodont Res,2003,38(3):290-295.

[3]劉琪,victor marino,mark bartold.新型牙周再生細胞傳遞載體的體外建立[J].華西口腔醫(yī)學(xué)雜志,2006,24(1):15-17.

[4]Kazuhiro O,Tomoyuki K,manaba M,et al.Platelet-Rich plasma contain high level of platelet-derived growth factor and transforming growth factor-β and modulates the proliferation of periodontally related cells in vitro[J].J Periodontol,2003,74:849-857.

[5]Gonshor A.Technique for producing platelet-rich plasma and platelet concentrate:background and process[J].Int J periodontics Restorative Dent,2002,22(6):547-555.

[6]Kazuhiro O,Tomoyuki K,manaba M,et al.Platelet-Rich plasma contain high level of platelet-derived growth factor and transforming growth factor–β and modulates the proliferation of periodontally related cells in vitro[J].J Periodontol,2003,74:849-857.

[7]劉琪，Victor M，Mark B.富血小板血漿和貧血小板血漿處理的生物降解膜對牙周韌帶成纖維細胞影響的掃描電鏡觀察[J].牙體牙髓牙周病學(xué)雜志，2004，14(8):439-442.

[8]Parkar MH,Kuru L,Giouzeli M,et al.Expression of growth factor receptors in normal and regenerating human periodontal cells[J].Arch Oral Biol,2001,46(3):275-284.

[9]Cho MI,Lin WL,Genco RJ.Platelet-derived growth factormodulated guided tissue regenerative therapy[J].J P-eriodontol,1995,66(6):520-530.

[10]Oates TW,Rouse CA,Cochran DL.Mitogenic effects of growth factors on human periodontal ligament cells in vitro[J].J Periodontol,1993,64(2):142-148.

[11]Dennison DK,Vallone DR,Pinero GJ,et al.Differential effect of TGF-beta 1 and PDGF on proliferation of periodontal ligament cells and gingival fibroblasts[J].J P-eriodontol,1994,65(7):641-648.

[12]林敏魁.富血小板血漿用于牙周組織再生的研究[J].J Clin Stomatal,2003,11(19):11-12.