復(fù)合誘變選育柚苷酶高產(chǎn)菌株的研究

李志堅(jiān)，譚興和，單 楊，李高陽

（1.湖南省農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，湖南長沙 410125；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，湖南長沙 410128）

柚皮苷（Naringin）是普遍存在于柑桔類水果中的一種雙氫黃酮類化合物，學(xué)名為柚配質(zhì)7-D-葡萄糖（2→1）-α-L 鼠李糖苷[1]，是柑桔鮮果及其制品中的主要苦味物質(zhì)。柑桔汁中含有一定苦味是保持產(chǎn)品特有風(fēng)味必不可少的[2]，但過量存在使產(chǎn)品出現(xiàn)過度苦味令消費(fèi)者難以接受，同時(shí)也影響和制約了柑桔加工業(yè)的發(fā)展。脫苦方法有很多種，如：酶法、吸附法、添加苦味抑制劑法[3]、超臨界CO2脫苦法、屏蔽脫苦法[2]等。酶法脫苦主要是利用柚苷酶在一定條件下分解柚皮苷成為無苦味物質(zhì)而達(dá)到脫苦的目的，具有其他方法所沒有的高效、快速及高選擇性、操作簡單、脫苦條件溫和、脫苦效率高和沒有副作用等優(yōu)點(diǎn)，因而具有良好的研究與應(yīng)用前景[4]。柚苷酶是由α-L-鼠李糖苷酶和β-D-葡萄糖苷酶組成的一種復(fù)合酶[5]，最初由Hall[6]從芹菜種子中分離得到的，后來Ting S V[7]曾在一些利用真菌生產(chǎn)的果膠酶制劑中發(fā)現(xiàn)并分離到這種酶。目前國內(nèi)外柚苷酶主要采用微生物發(fā)酵法進(jìn)行生產(chǎn)。但從自然界中篩選的產(chǎn)酶菌株其產(chǎn)酶能力一般都較弱，已有報(bào)道用紫外線照射[8]和化學(xué)誘變[9-10]方法可得到更高產(chǎn)酶能力的菌株。如陳玲等[11]用亞硝基胍（NTG）對柚苷酶生產(chǎn)菌出發(fā)菌株孢子進(jìn)行誘變處理，得到的菌株比出發(fā)菌株的產(chǎn)酶能力提高了近1倍。本文以自然界篩選的黑曲霉FY01-4為出發(fā)菌株，采用紫外線和60鈷自然衰變產(chǎn)生的γ射線作為誘變因子，對出發(fā)菌株進(jìn)行復(fù)合誘變處理，旨在篩選得到新的高產(chǎn)柚苷酶突變菌株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 黑曲霉FY01-4，酶活為357.9 U/mL，由湖南省農(nóng)產(chǎn)品加工研究所微生物實(shí)驗(yàn)室自行篩選保藏。

1.1.2 儀器 V-1 700型紫外-可見分光光度計(jì)、QHZ-98 A全溫度振蕩培養(yǎng)箱、紫外誘變箱（15 W紫外線燈）、磁力攪拌器、GNP-9160型隔水式恒溫培養(yǎng)箱、60 Co-γ射線輻射源、超凈工作臺等。

1.1.3 培養(yǎng)基 蔡氏培養(yǎng)基（Czapek’瓊脂）:蔗糖30.0 g/L，NaNO33.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，KCl 0.5 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g/L，K2HPO41.0 g/L，瓊脂15.0 g/L，pH 6.0～6.5，0.1 MPa蒸汽滅菌 20 min。柚苷低糖培養(yǎng)基：MgSO4·7H2O 5 g/L，K2HPO410.0 g/L，KCl 5.0 g/L，F(xiàn)eSO40.1 g/L，瓊脂 12.0 g/L，蔗糖10.0 g/L，柚苷 2.5 g/L，自然 pH 值（6.0～6.5），0.1 MPa蒸汽滅菌20 min。搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基：豆渣（含水40%～50%）10%，豆粕4%，葡萄糖2%，柚苷0.02%，自然 pH 值，250 mL三角瓶裝 30～50 mL，0.1 MPa蒸汽滅菌30 min。

1.1.4 誘變劑 以紫外線、60Co-γ射線作誘變劑。

1.2 方法

1.2.1 誘變選育 誘變選育程序如下：出發(fā)菌株→紫外誘變→平板分離→搖瓶篩選→60 Co-γ射線誘變→平板分離→搖瓶篩選→穩(wěn)定性試驗(yàn)[12]。

單孢子懸浮液的制備：出發(fā)菌株斜面30℃培養(yǎng)4～5 d，用無菌生理鹽水洗下孢子，轉(zhuǎn)入盛有100 mL生理鹽水帶玻璃珠三角瓶中，在震蕩器上震蕩1 h，充分打散孢子，經(jīng)無菌漏斗（內(nèi)有脫脂棉）過濾除去菌絲，取樣計(jì)數(shù)并用無菌生理鹽水調(diào)整孢子濃度至l06個(gè)/mL，制成單孢子懸浮液。

紫外誘變：將孢子懸液裝入帶有磁力攪拌子的無菌培養(yǎng)皿（直徑9 cm）內(nèi)，置于磁力攪拌器上，距離15 W紫外燈25 cm進(jìn)行紫外照射，照射時(shí)間分別為 0、30、60、90、120、150、180、210、240、270 s，然后取不同照射劑量的處理液適當(dāng)稀釋涂布平板，于恒溫30℃避光培養(yǎng)4 d。培養(yǎng)后對活菌進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算致死率并繪制致死曲線。從致死曲線中找出致死率為80%左右的誘變劑量，并以該劑量正式處理孢子懸液，然后涂布平皿，挑取單菌落進(jìn)行搖瓶篩選，測定其發(fā)酵液酶活。

60Co-γ射線誘變：經(jīng)紫外誘變篩選后，將所得菌落制備成孢子懸液，分別吸取10 mL孢子懸液裝入27支無菌試管，每3個(gè)為1組，共分為9組，于30℃恒溫振蕩培養(yǎng) 1 h。分別以 0、150、300、450、600、750、900、1 050、1 200 Gy 劑量的 γ 射線處理。將處理液稀釋涂布平板，于30℃避光培養(yǎng)4 d，進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，計(jì)算致死率，并繪制致死曲線。從致死曲線中找出致死率為80%左右的誘變劑量，并以該劑量正式處理孢子懸液，然后涂布平皿，挑取單菌落進(jìn)行搖瓶篩選，過濾后測定發(fā)酵液酶活。

菌株的搖瓶篩選：誘變后的孢子懸液涂布平板后，分離得到的單菌落經(jīng)斜面培養(yǎng)成熟后用無菌水洗滌孢子，制成終濃度為106個(gè)/mL的孢子懸液，按10%的接種量接種于裝有30 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中，30℃回旋式搖床180 r/min培養(yǎng)5 d，發(fā)酵后過濾，測定發(fā)酵液酶活。

遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)：將復(fù)篩得到的產(chǎn)酶活力較高的菌株連續(xù)傳代10代，分別測定菌株產(chǎn)柚苷酶活力。孢子計(jì)數(shù)采用血球計(jì)數(shù)法在顯微鏡下直接計(jì)數(shù)，誘變致死率采用平板活菌計(jì)數(shù)來測定。

1.2.2 柚苷酶活力的測定 取搖瓶培養(yǎng)物，以3 000 r/min離心20 min，所得的上清液即為粗酶液。取2 mL 0.1%柚苷標(biāo)準(zhǔn)溶液和0.2 mol/L、pH 4.0醋酸緩沖液1.9 mL置于試管中，在40℃恒溫水浴中預(yù)熱4～5 min，然后加入預(yù)先稀釋好的酶液0.1 mL，充分搖勻，準(zhǔn)確保溫30 min，迅速吸取0.1 mL，置于15 mL的比色管中，加入90%一縮二乙二醇（DEG）5 mL，蒸餾水0.4 mL和1 mol/L NaOH溶液0.5 mL，搖勻，在30℃保溫 30 min，倒入厚度為 1 cm的比色皿中，在420 nm波長下測定光密度。柚苷酶活力的定義為：在40℃，pH 4.0條件下每分鐘每毫升酶液分解柚皮苷的微克數(shù)[1]。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理與分析 致死率（%）=（未經(jīng)誘變菌液菌落總數(shù)－誘變后菌液菌落總數(shù)）/未經(jīng)誘變菌液菌落總數(shù)×100

正變率（%）=誘變后酶活力增加的菌株總數(shù)/誘變后菌株總數(shù)×100

2 結(jié)果與分析

2.1 紫外線誘變劑量的選擇

以紫外照射時(shí)間為橫坐標(biāo)，致死率為縱坐標(biāo)，繪制致死曲線（見圖1）。從圖l可以看出，當(dāng)照射時(shí)間為210 s時(shí)，出發(fā)菌株幾乎全部致死，而當(dāng)照射時(shí)間為180 s時(shí)，致死率在80%左右。由于致死率在80%左右時(shí)正突變的機(jī)率較高，故選擇180 S作為紫外誘變劑量。

圖1 紫外線致死曲線及突變率

2.2 紫外誘變篩選

以180 s作為紫外誘變劑量對出發(fā)菌株孢子懸液進(jìn)行誘變，共挑取出60個(gè)突變株，經(jīng)過搖瓶篩選，其中27個(gè)突變株的柚苷酶活較出發(fā)菌株有明顯提高。最高8株的酶活如圖2所示。突變株UV13的產(chǎn)酶酶活最高，為848.5 U/mL，是出發(fā)株的2.37倍，故選擇突變株UV13作為下一步誘變的菌株。

圖2 紫外誘變結(jié)果

2.3 60Co-γ射線輻照劑量與致死率的關(guān)系

通過觀察60Co-γ射線的誘變劑量與菌體致死率之間的關(guān)系，按照誘變劑量選擇的一般原則，選取菌體致死率大約在60%～95%之間的誘變劑量來觀察其正突變率。如圖3所示，不同劑量的γ射線對誘變菌株均有致死作用，且致死率隨輻照劑量的增加而提高，當(dāng)劑量為750 Gy時(shí)，細(xì)胞致死率達(dá)80%，此時(shí)正變率較高，而劑量達(dá)到900 Gy時(shí)，致死率接近100%，根據(jù)篩選微生物菌種的要求及以上結(jié)果，確定750 Gy為合適輻照劑量。

圖3 照射劑量與致死率、突變率曲線

2.4 60Co-γ射線誘變篩選

以750 Gy作為60Co-γ射線誘變劑量照射突變株UV13制成的孢子懸液，經(jīng)柚苷低糖培養(yǎng)基培養(yǎng)共篩選出35個(gè)突變株，經(jīng)搖瓶復(fù)篩，其中20個(gè)突變株的發(fā)酵酶活較出發(fā)菌株高，以其中酶活最高的8株和紫外誘變篩選出的UV13的發(fā)酵酶活繪圖（見圖4）。從圖4可看出，突變株C15的發(fā)酵酶活最高，為1 285.6 U/mL，是出發(fā)株的3.59倍、紫外誘變株UV13的1.52倍。

圖4 60Co-γ射線誘變結(jié)果

2.5 突變株C15遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)

由于經(jīng)誘變所得到的菌株產(chǎn)酶性狀常常不穩(wěn)定，尤其在連續(xù)傳代培養(yǎng)時(shí)。為了考察誘變菌株C15產(chǎn)酶能力的穩(wěn)定性，我們將其在斜面上連續(xù)移接10代，進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，如圖5所示，其子代的酶活基本保持在1 200～1 300 U/mL之間，產(chǎn)酶能力穩(wěn)定。

圖5 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論與討論

紫外線輻射能引起DNA鏈的斷裂、DNA分子內(nèi)和分子間的交聯(lián)、核酸與蛋白質(zhì)的交聯(lián)以及胞嘧啶和尿嘧啶的水合作用等從而導(dǎo)致基因突變，常被應(yīng)用于誘變育種上。60Co-γ射線作為一種電離射線，它可引發(fā)生物基因突變和染色體畸變[13]。因此，通過紫外線和60Co-γ射線對菌株進(jìn)行復(fù)合誘變處理可能會產(chǎn)生有利于生產(chǎn)的突變從而選育到優(yōu)良菌株。研究表明，經(jīng)過紫外誘變所得突變株UV13的發(fā)酵酶活是出發(fā)株的2.37倍。在紫外誘變的基礎(chǔ)上，利用60Co-γ射線進(jìn)行復(fù)合誘變，可進(jìn)一步提高酶活，最終突變株C15搖瓶發(fā)酵酶活達(dá)1 285.6 U/mL，分別是出發(fā)株和紫外誘變株的3.59倍和1.52倍，酶活明顯提高。經(jīng)傳代試驗(yàn)，該突變株具有穩(wěn)定的遺傳性狀。但作為生產(chǎn)用菌株，還需進(jìn)一步優(yōu)化其發(fā)酵產(chǎn)酶條件及發(fā)酵工藝，深入研究各種環(huán)境因素對菌株產(chǎn)酶的影響。另外，傳統(tǒng)誘變方法無法產(chǎn)生定向突變，難以找到與性狀改變相對應(yīng)的基因改變，不能從根本上掌握微生物的代謝調(diào)控機(jī)理，且篩選的工作量大、育種周期長，故可以考慮將傳統(tǒng)誘變方法與分子生物學(xué)方法相結(jié)合對菌株進(jìn)行改造，進(jìn)一步提高育種效率[14]，篩選到產(chǎn)酶性狀更加優(yōu)良的菌株。

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