顯齒蛇葡萄(藤茶)愈傷組織培養的研究

周 耀 李思長 劉 毓 王雙雙

（湖南農業大學·長沙·410128）

顯齒蛇葡萄(Ampelopsis grossedentata)為葡萄科、蛇葡萄屬木質藤本植物,主要分布于廣東、廣西、云南、貴州、湖南、湖北、江西、福建等省區[1],為民間習用草藥之一。據記載[2],該藥性涼,味甘淡,具有清熱解毒之功效,主治黃疸型病毒性肝炎、風熱感冒、咽喉腫痛、癰瘡等癥。顯齒蛇葡萄的愈傷組織誘導少見報道。本文以顯齒蛇葡萄不同的部位為外植體,研究其在不同基本培養基、植物生長調節劑以及培養條件下愈傷組織的誘導效應,確定愈傷組織誘導和增殖的最適培養基及培養條件。

1 材料與方法

1.1 材料

引種自湖南綏寧縣。選取健壯植株中上部外圍生長旺盛的幼莖作為供試材料。

1.1.1 外植體的選取

莖尖：取3cm左右長的帶頂芽莖段,在解剖鏡下逐層去除幼葉,切取0.12～0.13mm左右大小的莖尖分生組織。

帶芽莖段：將發育良好的幼嫩莖段去除頂芽與葉片,切成長約1cm的帶芽莖段。

葉片:選取黃綠色幼葉,去除幼葉邊緣,切成1cm2左右的小塊。

葉柄：選取較幼嫩的成熟葉片的葉柄,頂端帶少量葉片,長約1cm。

1.1.2 繼代培養材料的選取

生長良好的初代愈傷組織。

1.2 方法

1.2.1 培養基的制備

以MS、B5為基本培養基，添加不同濃度的2，4-D，6-BA，NAA，KT 等植物生長調節劑，并添加不同濃渡的椰子汁、蔗糖，pH值為5.8～6.0。

繼代培養基：不同濃度梯度的NAA與2，4-D組合。

1.2.2 外植體的消毒、接種與培養條件

流水沖洗幼枝2～3h,洗凈后在超凈工作臺上用70%酒精快速處理30s，用無菌水沖洗一次，再用0.1%升汞（HgCl2）浸泡：嫩葉浸泡 5min，莖段、葉柄浸泡7～8min，無菌水沖洗多次；接種在不同的培養基上；培養條件：溫度為25℃～26℃，光照強度開始為 250～300Lx、 后轉為 2000～3000Lx， 光照時間（14h/d）,相對濕度為 75%～85%。

2 研究內容

①不同培養基愈傷組織的誘導；②不同外植體愈傷組織的誘導；③葉片正、背面朝上對愈傷組織的誘導；④不同光照強度下愈傷組織的誘導；⑤不同光照時間愈傷組織的誘導；⑥添加不同椰子汁用量愈傷組織的誘導；⑦不同植物生長調節劑濃度組合的愈傷組織誘導；⑧不同植物生長調節劑組合的繼代培養。

3 結果與分析

3.1 不同培養基對顯齒蛇葡萄愈傷組織誘導的影響

將顯齒蛇葡萄幼葉接種在含有2，4-D 2mg/L+KT0.2mg/L+100ml/L椰子汁+蔗糖2%+瓊脂0.7%的不同基本培養基上（MS、B5），每種處理10瓶，每瓶外植體5塊，培養15d，觀察統計出愈率與愈傷生長情況（表1）。

從表1可知，MS培養基對顯齒蛇葡萄幼葉愈傷組織的出愈率最高（90%）、長勢好，B5培養基的出愈率最低（65%）、生長情況也最差。

MS培養基中無機鹽的濃渡高，能滿足愈傷組織對礦物質營養的要求，愈傷組織生長快，同時銨鹽和銷酸鹽的含量高，且比例適合，不需要添加更多的有機附加物；改良MS培養基是在MS培養基的配方中把無機鹽的含量減少了一半配制而成，出愈率及愈傷生長自然隆低；銨可能對不少培養物的生長有抑制作用，B5中銨鹽濃度較低，可能反而較大地限制了顯齒蛇葡萄愈傷的形成和生長。

表1 不同基本培養基對愈傷組織的影響Table 1 The effect on callus induction ofdifferent basic media

3.2 不同外植體愈傷誘導效果比較

將不同外植體（葉片、葉柄、莖段和莖尖）分別接種在 MS+2，4-D 2mg/L+KT 0.2mg/L+100ml/L 椰子汁+蔗糖2%+瓊脂0.7%的培養基上培養，每種處理10瓶，7～12d外植體開始萌動，并隨后產生愈傷組織，結果見表2。

表2 不同外植體的愈傷誘導效果比較Table 2 The induction ofcallus from different explant

從表2可知，葉片外植體的出愈率高達93%，要明顯高于葉柄的（85.7%）和莖段的（81.2%），且愈傷生長狀況較好。

葉片外植體出愈率高的原因可能是因為幼嫩葉片的細胞分化程度較低，因而具有較大的脫分化潛力；且與培養基接觸面積大，對添加的植物生長調節劑更為敏感。莖尖外植體未見愈傷產生，可能有兩個原因：一是試驗操作有誤，如莖尖剝離時去掉了頂端分生組織；二是因為取材時間是秋天，已近休眠時間。

3.3 葉片正背面朝上對顯齒蛇葡萄愈傷組織誘導的影響

將切好的葉片以正面朝上和背面朝上，分別接種于 MS+2，4-D 2mg/L+KT 0.2mg/L+100ml/L 椰子汁+蔗糖2%+瓊脂0.7%的培養基上，每處理5瓶，弱光培養15d，結果見表3。

表3 葉片正背面朝上對愈傷組織誘導的影響Table 3 The effect on callus induction ofleafin different side

由表3可知，正面朝上葉片的出愈率為93.3%，明顯高于背面朝上的（60%）處理，且啟動時間短。這可能與葉片的結構有關。顯齒蛇葡萄正面朝上，葉片背面氣孔較多，且靠近疏松的海綿組織，利于吸收，因此葉片背面接觸培養基培養更為適宜。同時還發現，葉片背面朝上接種產生的愈傷組織褐色較明顯。

3.4 光照強度對齒蛇葡萄愈傷組織誘導的影響

將接種的葉片在25℃恒溫培養室進行光照強度分組試驗，設以下三種光照強度：①2000～2500Lx：每層培養架用4支40W日光燈照明，直射光；②1000～1250Lx：每層培養架用2支40W日光燈照明，直射光；③250～350Lx：放在另外一層不開燈的架子上，僅靠旁邊培養架上的散射光。20d后統計結果（表4）。

表4 不同光照強度對愈傷組織誘導的影響Table 4 The effect on callus induction of different light intensity

由表4可知，光照強度對顯齒蛇葡萄葉片愈傷組織誘導效果的影響較顯著：在暗培養下，愈傷誘導率最高（94.2%），但愈傷質地疏松；在弱光（250～350Lx）下出愈率最高達92.5%，愈傷呈淺綠色，質地致密，質量好；當光強達2000～2500Lx時，出愈率急劇下隆至52%，且質地疏松。因此，顯齒蛇葡萄愈傷誘導以弱光誘導為最佳。

3.5 光照時間對顯齒蛇葡萄愈傷組織誘導的影響

將葉片接種在MS+2，4-D 2mg/L+KT 0.2mg/L+100ml/L椰子汁+蔗糖2%+瓊脂0.7%的培養基上，在培養溫度25℃、光照強度250～350Lx、培養瓶中葉片距光源約400mm的條件下，設置光照時間梯度 10h/d、12h/d、14h/d 和 16h/d， 每處理 13 瓶，15d后統計結果（表5）。

表5 不同光照時間對愈傷組織誘導的影響Table 5 The effect on callus induction ofdifferent illumination time

由表5可見，光照時間為14h/d時外植體出愈率最高，同時愈傷生長狀況最好；隨著光照時間縮短，出愈率下降較明顯；但光照時間高達16h/d時，則容易出現愈傷褐化現象。綜合表4和表5發現，較長時間弱光條件利于顯齒蛇葡萄葉片愈傷的誘導，可能是因為可誘導愈傷形成的植物激素的產生依賴于光的存在[4]。

3.6 椰子汁用量對顯齒蛇葡萄愈傷組織誘導的影響

培養基中加入椰子汁，常能有效提高愈傷組織誘導率。將切好的葉片接種在MS+2，4-D 2mg/L+KT 0.2mg/L+蔗糖2%+瓊脂0.7%的培養基上，依次調節椰子汁的用量，每處理3瓶，15 d后統計愈傷組織誘導結果（表6）。

表6 不同椰子汁用量對愈傷組織誘導的影響Table 6 The effectoncallus inductionofcoconutmilk concentration

從表6可看出，椰子汁用量為100ml/L時為最合適用量，該處理的出愈率最高，用量過多或過少時，出愈率均有所下降。

3.7 不同植物生長調節劑濃度組合對顯齒蛇葡萄愈傷組織誘導的影響

在獲得最佳培養基上，以嫩葉為外植體，設置4 個因素分別為 6-BA、2，4-D、NAA、KT 根據 5 因素 4 水平設計 L16（54）（表7），15d 后統計愈傷組織誘導結果，正交試驗[5～7]，結果見表8。

表7 正交因素表Table 7 The table of orthogonal experiment

表8 正交試驗結果Table 8 The results of orthogonal experiment

從表8中可看出，通過正交實驗得出植物生長調節劑影響因子排序為：6-BA〉KT〉NAA〉2，4-D；最佳組合為 6-BA （1.5mg/L）+KT(0.15mg/L)+NAA(0.2mg/L)+2，4-D（2mg/L）。將最佳實驗組合重復實驗3次，與正交實驗結果一致。同時發現高濃度的6-BA容易導致愈傷出現褐化現象。

3.8 不同植物生長調節劑組合對顯齒蛇葡萄繼代培養的影響

在獲得初代培養最佳基本培養基上，生長良好的初代愈傷作為繼代培養的材料，以MS為基本培養基，分別設置不同的植物生長調節劑NAA和2，4-D的組合，添加100ml/L椰子汁+蔗糖2%+瓊脂0.7%，試驗重復三次。繼代培養15d天后，統計試驗結果（表9）。

愈傷組織繼代培養所用的植物生長調節劑最佳組合為：1.5mg/LNAA+0.5mg/L2,4-D。繼代培養出的愈傷組織呈團塊狀，黃綠色，結構較致密，增殖率較高。

據報道[8]，培養物褐變是由于培養物含有的豐富多酚化合物在多酚氧化酶的作用下氧化所致，在培養基中加入抗氧化劑，對防止某些植物培養物的褐變具有一定的效果。

表9 不同植物生長調節劑組合對繼代培養的影響Table 9 The effect on genetated culture of different hormone combination

3 結論

顯齒蛇葡萄以葉片為外植體誘導愈傷組織明顯優于其它外植體，且以葉片正面向上為佳。經過單因素試驗和正交試驗得出最佳的培養條件是：在培養基MS+1.5mg/L 6-BA+0.15mg/L KT+0.2mg/L NAA+2mg/L 2,4-D+100ml/L椰子汁上，光照強度為250～350Lx，每日光照時間為14h，出愈率最高，且愈傷組織生長狀況最好。

1 中國科學院植物研究所，中國高等植物圖鑒（二冊）補編[M].北京：科學出版社，1883：349～356.

2 鄭小紅，劉金龍，向班貴，等.顯齒蛇葡萄新品種——綠鳳[J].園藝學報，2004，31（5）：701

3 杜和平.開封菊花的部分品種的外植體再生體系的研究 [J].現代農業科學，2009，16（7）：19～20.

4 HARTMANN F.uberdiaWirkungdesPhytochromsBeim.Laubmooskal-lus.I.Photomorphogenese und Stoffwechsel[J].Beitr,Biopfl cmzeu,1973,49:1～34.

5 張恒基，柏新富，劉林德，等.芫花愈傷組織的分化與植株再生[J]林業科技，2009，34（4）：78～81.

6 胡長玉，張霄雯.柳葉蠟梅葉片愈傷組織誘導實驗研究[J].中國林副特產，2009，108（4）：11～12.

7 柴 淳，黎云祥，陳光登，等.白勒愈傷組織培養條件優化及總黃酮含量測定[J].光譜實驗室，2009，26（4）：939～943.

8 周仁超，姚崇懷.紫斑牡丹胚培養與植株再生[J].亞熱帶植物科學，2001，30（3）：601