AngⅡ?qū)HP-1源巨噬細(xì)胞高密度脂蛋白受體表達(dá)的影響

李 芳,楊志明,肖傳實(shí),康玉明

動(dòng)脈粥樣硬化(AS)的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)極其復(fù)雜的病理生理過(guò)程,血脂代謝紊亂與其密切相關(guān),血漿脂質(zhì)水平升高可促使大量脂質(zhì)尤其是膽固醇進(jìn)入動(dòng)脈壁,最終導(dǎo)致AS病變形成。膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)(RCT)過(guò)程對(duì)機(jī)體具有抗AS的保護(hù)作用。SR-B1是一種高密度脂蛋白(HDL)生理性相關(guān)受體,是第一個(gè)在分子水平上得到證實(shí)的HDL受體。已有研究證實(shí),RCT過(guò)程中包括細(xì)胞膽固醇的流出等關(guān)鍵步驟均需SR-B的參與[1]。

腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)參與了AS的發(fā)生過(guò)程。血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)是RAS的主要活性成分,是一種加速AS成的重要危險(xiǎn)因子[2]。Wolf等[3]的研究首次發(fā)現(xiàn),AngⅡ能下調(diào)近端腎小管細(xì)胞SR-B1的表達(dá)。有關(guān)AngⅡ?qū)奘杉?xì)胞SRB1表達(dá)的影響尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究擬以THP-1源性巨噬細(xì)胞為對(duì)象,觀察AngⅡ?qū)HP-1源性巨噬細(xì)胞SR-B1表達(dá)的影響,探討AngⅡ促進(jìn)AS的新機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 人THP-1單核細(xì)胞(購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù));AngⅡ、佛波脂(PMA)均為美國(guó) Sigma公司產(chǎn)品;RPMI1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶(美國(guó)GIBCO/BRL公司);總 RNA提取試劑盒(Trizol)美國(guó)Promega公司;SR-BI引物、β-actin引物(內(nèi)參)大連寶生物有限公司;胎牛血清(杭州四季青公司);兔抗人SR-B1多克隆抗體(Santa Cruz公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 THP-1細(xì)胞用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液,37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng),在每次實(shí)驗(yàn)前用160 nmol/L PMA孵育 THP-1細(xì)胞 36 h,使其誘導(dǎo)分化成巨噬細(xì)胞。分組并計(jì)數(shù),實(shí)驗(yàn)共分5組,即對(duì)照組(AngⅡ0 nmol/L)、AngⅡ10 nmol/L、AngⅡ100 nmol/L、AngⅡ1000 nmol/L、AngⅡ10000 nmol/L,各組作用24 h后收集細(xì)胞,用于SR-B1表達(dá)的檢測(cè)。

1.2.2 RT-PCR法檢測(cè)THP-1巨噬細(xì)胞SR-B1mRNA表達(dá)T rizol法提取總RNA,SR-B1表達(dá)水平以目的mRNA與內(nèi)參照人β-actin灰度值之比表示。引物序列由大連寶生物有限公司合。人THP-1巨噬細(xì)胞SR-B1引物序列,上游引物:5'-ctgtgggtgagatcatgtgg-3',下游引物:5'-gttccacttgtccacgaggt-3',擴(kuò)增片段 191bp;人β-actin引物序列,上游引物:5'-tgaacgggaagctcactgg-3',下游引物:5'-tccaccaccctgttgctgga-3',擴(kuò)增片段為307bp。取各組細(xì)胞總 RNA 2 μ g反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA,再取反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物1 μ L進(jìn)行PCR循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后,取反應(yīng)產(chǎn)物5 μ L進(jìn)行2.0%瓊脂糖凝膠電泳,溴乙啶染色,UVP凝膠圖像分析系統(tǒng)掃描攝圖分析。

1.2.3 Western-blot蛋白印跡法檢測(cè)THP-1巨噬細(xì)胞 SR-B1蛋白表達(dá) 用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞,取總蛋白50 μ g進(jìn)行變性,SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。

2 結(jié) 果

2.1 巨噬細(xì)胞的分化鑒定 細(xì)胞呈圓形、懸浮生長(zhǎng),經(jīng)160 nmol/LPMA誘導(dǎo)分化36 h后,細(xì)胞停止增殖,由懸浮生長(zhǎng)變?yōu)橘N壁生長(zhǎng),且伸展偽足,呈巨噬細(xì)胞外形。

2.2 THP-1巨噬細(xì)胞SR-B1表達(dá)的檢測(cè) THP-1巨噬細(xì)胞與不同濃度 AngⅡ(對(duì)照組 0 、10 nmol/L、100 nmol/L、1 000 nmol/L、10 000 nmol/L)孵育24 h后,RT-PCR檢測(cè) T HP-1巨噬細(xì)胞SR-B1mRNA的表達(dá)。結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,AngⅡ使THP-1巨噬細(xì)胞SR-B1mRNA的表達(dá)下調(diào),且呈劑量依賴關(guān)系(P＜0.05)。詳見(jiàn)表1。

Western印跡方法檢測(cè)各組細(xì)胞SR-BI蛋白質(zhì)的表達(dá)。結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,AngⅡ使THP-1巨噬細(xì)胞SR-B1蛋白質(zhì)的表達(dá)下調(diào),且呈劑量依賴關(guān)系(P＜0.05)。詳見(jiàn)表2。

表1 各組 THP-1源巨噬細(xì)胞SR-B1 mRNA表達(dá)(±s)

表1 各組 THP-1源巨噬細(xì)胞SR-B1 mRNA表達(dá)(±s)

組別 n SR-B1對(duì)照組 6 0.86±0.05 10 mmol/L組 6 0.65±0.071)100 mmol/L組 6 0.47±0.031)1 000 mmol/L組 6 0.35±0.031)10 000 mmol/L組 6 0.24±0.031)與對(duì)照組相比,1)P＜0.05

表2 各組 THP-1源巨噬細(xì)胞SR-B1蛋白表達(dá)(±s)

表2 各組 THP-1源巨噬細(xì)胞SR-B1蛋白表達(dá)(±s)

組別 n SR-B1對(duì)照組 6 1.17±0.04 10 mmol/L組 6 0.89±0.021)100 mmol/L組 6 0.77±0.021)1 000 mmol/L組 6 0.61±0.021)10 000 mmol/L組 6 0.49±0.021)與對(duì)照組相比,1)P＜0.05

3 討 論

冠心病是人類排列前位的主要致死原因,國(guó)際著名的七國(guó)研究、美國(guó)弗萊明漢心臟研究和多危險(xiǎn)因素干預(yù)試驗(yàn)(MRFTI)均證實(shí)血漿膽固醇水平的升高是冠心病發(fā)生率、死亡率增高的最重要危險(xiǎn)因素。研究SR-B1缺失的小鼠發(fā)現(xiàn),不僅肝臟選擇性攝取膽固醇降低,AS損傷加劇,而且動(dòng)物易發(fā)冠心病并伴隨自發(fā)的心肌梗死、心力衰竭和死亡[4]。巨噬細(xì)胞SR-B1的表達(dá)對(duì)apoE-/-小鼠體內(nèi)的動(dòng)脈粥樣硬化病變的進(jìn)展有保護(hù)作用[5]。因此SR-B1的表達(dá)調(diào)控可能在AS的形成中起重要作用,如何調(diào)控SR-B1成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)。研究證實(shí),SR-B1在肝臟細(xì)胞、類固醇激素生成細(xì)胞或巨噬細(xì)胞的表達(dá)可因給予雌激素,過(guò)氧化物酶體增殖物活化受體拮抗劑、維生素E、多聚不飽和脂肪酸、膽固醇等而改變[6],然而對(duì)AS的形成與發(fā)展起重要促進(jìn)作用的AngⅡ是否對(duì)SR-B1表達(dá)有調(diào)控作用尚不清楚。

本實(shí)驗(yàn)顯示,AngⅡ能顯著抑制巨噬細(xì)胞SR-B1mRNA的表達(dá),并呈劑量依賴性(P＜0.05)。同樣AngⅡ能顯著抑制巨噬細(xì)胞SR-B1蛋白的表達(dá),且呈劑量依賴性(P＜0.05),并且其蛋白表達(dá)水平同mRNA表達(dá)水平一致。

本研究結(jié)果顯示,AngⅡ?qū) HP-1源性巨噬細(xì)胞SR-B1具有負(fù)性調(diào)控作用。因此AngⅡ促進(jìn)AS的一個(gè)重要機(jī)制就是通過(guò)抑制SR-B1的表達(dá),從而使巨噬細(xì)胞膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)受阻,導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化病變形成。

[1]Acton SL,Kozarsky KF,Rigotti A.The HDL receptor SR-B1:A new therapeutic target for atherosclerosis[J].Molecular Medicine Today,1999,5:518-524.

[2]Gorte K,Drexler H,Schieffer B.Rennin agiotensin systemn and atherosclerosis[J].NePhrol Dial Transplant,2004,19(4):770-773.

[3]Wolf G,Wenezl U,Jablonski K,et al.AngioetnsinⅡdown-regulates SR-B1 HDL receptor in proximal tublar cells[J].NePhrol Dial T ransplant,2005,20(6):1222-1227.

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[6]Krieger M.Charting the fate of the“ good cholesterol” :Identification and characterization of the high-density lipoprotein recepto r SR-B1[J].Annu Rev Biochem,1999,68:523-558.