丁苯酞對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷后促凋亡蛋白表達的影響1)

董 莎,劉瑞珍,李曉東

腦缺血再灌注損傷是多數缺血性腦血管疾病的主要病理生理過程[1],近年研究發現,缺血性腦損傷引起的神經元凋亡主要是由線粒體途徑介導的,在凋亡誘導因素作用下,線粒體可釋放促凋亡(Smac),其可進一步激活caspases程序 ,誘導細胞凋亡,Smac蛋白的發現完善并補充了線粒體為細胞凋亡調控中心的理論[2,3]。丁苯酞是我國第一個擁有自主知識產權的化學藥物,其多種抗缺血機制受到廣泛重視。本實驗采用不同方法觀察丁苯酞對大鼠局灶性腦缺血再灌注后Smac蛋白表達的影響,旨在探討其抗神經元凋亡機制。

1 材料與方法

1.1 動物及分組 健康雄性Wistar大鼠180只,體重200 g～250 g,山西醫科大學生理教研室動物中心提供,隨機分為假手術組、缺血再灌注組、丁苯酞治療組、丁苯酞預防組、丁苯酞預防加治療組,每組36只,各實驗組又分為缺血再灌注6 h、12 h、24 h 3個亞組。

1.2 主要試劑及儀器 丁苯酞膠囊:石藥集團恩必普藥業有限公司,批號:國藥準字08100111,用 tween 80溶液稀釋,給藥計量為80 mg/kg;兔抗大鼠Smac多克隆抗體,Smac(H-177):北京中杉生物技術有限公司;細胞凋亡檢測試劑盒(TUNEL):北京中杉生物技術有限公司;BI-2000醫學圖像分析系統(成都泰盟科技有限公司)由山西醫科大學生理教研室提供。

1.3 動物模型制備及給藥 動物模型制備參照Zea Longa法加以改良制作,假手術組魚線置入頸內動脈10 mm即可,余步驟同模型組。各組均在術后1 h～2 h大鼠清醒時行神經功能評分,其標準參照Berderson 5分制法進行,1分～3分判定為造模成功,0分、4分或死亡剔除,再隨機補充。造模成功的大鼠分別于再灌注6 h、12 h、24 h后麻醉,斷頭取腦,去除腦干和小腦,于固定液中固定24 h,常規脫水,石蠟包埋待用。

給藥,假手術組及缺血再灌注組采用缺血1 h后腹腔注射同體積生理鹽水;丁苯酞治療組于缺血1 h后腹腔注射丁苯酞稀釋液;預防組采用手術前一周連續灌胃給藥,每日2次,手術當天不給藥;預防加治療組采用術前一周連續灌胃給藥,缺血1 h后腹腔注射給藥1次。

1.4 免疫組化測Smac蛋白 取厚約 3 μ m的冠狀切片,常規脫蠟脫水,經H2O2及蒸餾水浸泡后PBS洗滌,滴加一抗100 μ L,4℃冰箱過夜,次日取出室溫放置30 min后PBS洗滌,滴加二 抗100μ L,37℃烤箱置20min后洗滌 ,DAB顯色 。采用BI-2000醫學圖像分析系統,測量Smac蛋白染色陽性細胞的平均灰度值。

1.5 TUNEL法測凋亡細胞 將凋亡檢測試劑盒中試劑1與2配成T UNEL反應混合物,計數T UNEL陽性細胞數。

1.6 Western檢測蛋白水平 取組織100 mg,加入蛋白裂解液1 mL(RIPA裂解緩沖液),勻漿,離心后取上清加入等體積的2×SDS buffer,煮沸5min,迅速冰浴,離心后取上清備用,SDSPAGE電泳,轉膜,封閉,一抗孵育:大鼠來源 Smac和beta-actin用TBST以1∶1 000稀釋,4℃過夜;二抗孵育:二抗以 1∶1 000稀釋,室溫孵育 2 h;ECL底物化學發光顯色,掃描,進行圖像分析。

1.7 統計學處理 SPSS 11.0軟件進行單因素方差分析,實驗結果用均數±標準差(±s)表示,檢驗水準為α=0.05。

2 結 果

2.1 HE染色觀察病理改變 假手術組腦組織形態結構基本正常,細胞密度大,缺血再灌注組缺血側腦組織結構較疏松,間質水腫,有散在空腔形成,且出現不同程度的神經元變性、壞死,神經細胞數目明顯減少,胞核形態不規則,輪廓模糊。治療組、預防加治療組腦組織形態結構大致正常,病理改變輕微,海馬區可見錐體細胞。

2.2 免疫組化結果 假手術組中Smac蛋白呈弱陽性表達,缺血再灌注組于再灌注6 h后Smac蛋白已經開始表達,再灌注24 h表達量最高,陽性細胞于胞漿胞核都著色,染色呈棕黃色顆粒,廣泛表達于大腦皮層和海馬。丁苯酞治療組、預防加治療組各時間點Smac蛋白表達較缺血再灌注組弱。詳見表1。

表1 大鼠腦缺血再灌注后Smac蛋白表達圖像分析的灰度值(±s)

表1 大鼠腦缺血再灌注后Smac蛋白表達圖像分析的灰度值(±s)

組別 n 再灌注6 h 再灌注12 h 再灌注24 h假手術組 12 179.96±2.051) 179.81±2.681) 179.85±2.511)模型組 12 153.05±1.10 143.57±1.92 139.60±2.20治療組 12 169.08±1.681) 167.69±1.671) 157.02±2.001)預防組 12 153.98±2.11 144.01±2.95 139.73±3.12預防加治療組 12 175.74±2.361)2) 175.46±1.471)2) 166.27±2.001)2)與模型組同時間點比較,1)P＜0.05;與治療組同時間點比較,2)P＜0.05

2.3 TUNEL檢測結果 假手術組凋亡細胞偶可見;缺血再灌注組各時間點在大腦皮層和海馬區凋亡細胞表達較多,表現為細胞核固縮,內散在棕黃色顆粒。其中以缺血再灌注24 h凋亡細胞表達最多;丁苯酞治療組、預防加治療組凋亡細胞數較少。詳見表2。

表2 大鼠腦缺血再灌注后細胞凋亡數(±s)個/400倍視野

表2 大鼠腦缺血再灌注后細胞凋亡數(±s)個/400倍視野

組別 n 再灌注6 h 再灌注12 h 再灌注24 h假手術組 12 3.08±1.001) 3.67±0.991) 4.50±1.781)模型組 12 26.58±2.64 27.00±2.89 27.33±3.73治療組 12 17.17±2.731) 17.33±2.311) 17.33±2.841)預防組 12 24.00±1.60 26.67±2.35 26.67±3.26預防加治療組 12 13.58±1.931)2) 13.58±1.981)2) 14.00±2.801)2)與模型組同時間點比較,1)P＜0.05;與治療組同時間點比較,2)P＜0.05

2.4 Western blot檢測結果 以 Smac蛋白/β-actin作為比較指標,提示假手術組中僅有少量Smac蛋白,缺血再灌注組Smac蛋白含量顯著增多,其與β-actin的比值大于1,治療組與預防加治療組中的Smac蛋白含量較缺血再灌注組明顯減少。詳見表3。

表3 Western bolt檢測Smac蛋白/β-actin結果(±s)

表3 Western bolt檢測Smac蛋白/β-actin結果(±s)

組別 n 再灌注后24 h假手術組 36 0.825±0.0151)模型組 36 1.218±0.018治療組 36 0.964±0.0231)預防組 36 1.212±0.027預防加治療組 36 0.931±0.0121)2)與模型組比較,1)P＜0.05;與治療組比較,2)P＜0.05

3 討 論

近來研究表明在缺血缺氧所致的神經元凋亡機制中,線粒體通路起主導作用,凋亡刺激引起線粒體膜通透性變化,可誘導其釋放一種促凋亡蛋白-Smac[4,5]。XIAP是IAPs蛋白酶家族中普遍存在的內源性凋亡蛋白抑制劑,其抑制Caspases活性作用能被多種基因負性調控,Smac是其中之一,因其可直接與IAP結合,故又命名為低等電點的IAP直接結合蛋白。正常情況下Smac位于線粒體內膜腔,當線粒體受到凋亡信號刺激膜孔開放即移位到胞漿與XIAP的BIR3結構域競爭性結合解除其對Caspase-9的抑制,與XIAP的BIR2結構域競爭性結合則解除其對Caspase-3的抑制[6],而且Smac還可通過與胞質內的Apaf-1形成凋亡復合體、與效應Caspases相互作用等多種途徑增加細胞對凋亡信號的敏感性,這均是Smac蛋白促進神經細胞凋亡造成繼發性腦損傷的原因。

丁苯酞與南方水芹菜籽中提取的左旋芹菜甲素的結構相似,動物藥效學研究提示,其可阻斷缺血性腦卒中所致腦損傷的多個環節,具有較強的抗缺血作用,可明顯縮小大鼠局部腦缺血的梗死面積,減輕腦水腫,改善腦能量代謝和缺血區的微循環和血流量。

本實驗研究了Smac蛋白在腦缺血再灌注損傷后的表達及丁苯酞對其的影響,觀察到腦缺血再灌注損傷6 h后胞漿中Smac蛋白的免疫陽性細胞增多,24 h表達最多,并且胞漿和胞核都著色[7],提示Smac蛋白可能參與了腦缺血損傷的病理過程。丁苯酞治療組、預防加治療組各時間點Smac蛋白的表達均較缺血再灌注組低,提示丁苯酞可能通過下調Smac蛋白的表達發揮保護神經細胞的作用。丁苯酞提前預防組陽性細胞的表達同模型組比較尚不能認為有統計學意義,而丁苯酞預防加治療組中陽性細胞的表達卻明顯低于治療組,因此丁苯酞預防腦缺血再灌注損傷的作用機制尚待研究。

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