兔視網(wǎng)膜挫傷后視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮水通道蛋白4的表達(dá)

付 群 師學(xué)偉 李 爽 王志玉 任芳芳

1 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院眼科（453000）

2 焦作市五官醫(yī)院（454000）

3 新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院（453000）

4 福建省寧德市閩東醫(yī)院（355000）

視網(wǎng)膜挫傷是指眼部受到鈍性外力擊打所引起的視網(wǎng)膜損傷，其主要表現(xiàn)是急性視力損害和視網(wǎng)膜水腫、變性、出血、壞死，其發(fā)病機(jī)制尚未完全明了[1]。水通道蛋白4（aquaporin-4，AQP-4）在機(jī)體中介導(dǎo)各種類型細(xì)胞膜的水轉(zhuǎn)運[2]，在眼部也有廣泛分布[3]。本文通過對實驗性兔視網(wǎng)膜挫傷后不同時間段視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮AQP-4表達(dá)特點進(jìn)行觀察，以期進(jìn)一步了解視網(wǎng)膜挫傷的發(fā)病機(jī)制。現(xiàn)報道研究結(jié)果如下。

1 材料與方法

1.1 儀器設(shè)備和試劑

Olympus光學(xué)顯微鏡；普通電冰箱（新飛電器集團(tuán)）；恒溫培養(yǎng)箱（蘇州醫(yī)療儀器廠）；恒溫電熱烤箱（蘇州醫(yī)療儀器廠）；1/100000電子天平（上海光學(xué)儀器廠）；圖象分析系統(tǒng)（美國Media Cybernetics 公司）；AQP-4試劑盒（北京博奧森公司）；其他試劑均為國產(chǎn)分析純級；生理鹽水為醫(yī)用無菌制劑。

1.2 動物分組及模型制作

1.2.1 動物與分組

健康無眼疾成年大白兔42只（二級，新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院動物中心提供），體質(zhì)量2～2.5kg，雄雌兼用；飼養(yǎng)條件：開放系統(tǒng)，溫度18～29℃，日溫差≤3℃，相對濕度為40%～70%，換氣量12次/h，氨氣濃度≤14mg/m3，噪聲≤30dB，工作照度約200Ix，晝夜明暗交替時間12h/12h，普通飲水和全價飼料喂養(yǎng)。外眼及眼底檢查正常，選取右眼為致傷眼；隨機(jī)（隨機(jī)數(shù)字表法）分為挫傷后1h組、3h組、1d組、3d組、7d組、14d組和正常對照組共7組，各組均為6只。

1.2.2 視網(wǎng)膜挫傷模型制作

王志玉等[4]改良重?fù)舴ǎ聜芰考s為2.87 J（E=mgh）。所有造模由同一操作者序貫完成。

1.2.3 眼部傷情觀察

實驗家兔均在同一條件、不同時間點進(jìn)行眼部傷情觀察，檢查眼球位置、結(jié)膜、角膜、前房、瞳孔、晶狀體、玻璃體和視網(wǎng)膜；眼底檢查是在用散瞳劑充分散瞳后用直接檢眼鏡對包括周邊部在內(nèi)的眼底結(jié)構(gòu)進(jìn)行細(xì)致的檢查。眼部檢查由同一名高年資眼科醫(yī)師完成。

1.2.4 動物模型制作成功的判斷

傷眼直接對光反應(yīng)遲鈍，瞳孔散大；檢眼鏡觀察眼底可見視網(wǎng)膜乳白色混濁、水腫范圍較大，同時伴有眼底出血，即認(rèn)為模型制作成功，納入實驗。制模后結(jié)膜囊內(nèi)涂紅霉素眼膏。

1.3 標(biāo)本制備和視網(wǎng)膜AQP-4表達(dá)檢測

在規(guī)定時間點經(jīng)由耳緣靜脈空氣栓塞處死各挫傷組兔子；于14d按上法處死正常對照組受試兔子；處死受試兔子后，迅速摘除受試眼球，置于冰臺上，修剪眼球表面的多余組織，0～4℃生理鹽水沖洗3次，沿角鞏膜緣后3～5mm處環(huán)形剪開眼球，剪除眼前節(jié)（角膜、虹膜、晶狀體等）和玻璃體，翻轉(zhuǎn)眼球壁使視網(wǎng)膜暴露于表面，用吸耳球沿視網(wǎng)膜周邊部吹打視網(wǎng)膜表面，這樣視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層將脫離起來，此時可輕松剝?nèi)∫暰W(wǎng)膜。然后按照AQP-4試劑盒說明書要求由專人嚴(yán)格操作；AQP-4表達(dá)以細(xì)胞膜呈不同程度的棕黃色為陽性，陰性結(jié)果無棕黃色表達(dá)。結(jié)果用圖象分析處理系統(tǒng)測量灰度值；每個標(biāo)本任意選擇15個視野來檢測陽性表達(dá)細(xì)胞的灰度值：灰度值高表示AQP-4含量高，灰度值低表示AQP-4含量低。AQP-4灰度值以±s表示。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計學(xué)處理；致傷組與對照組間均值的兩兩比較用t檢驗，致傷組各組間的差異分析用單因素方差分析（F檢驗），為雙側(cè)檢驗；檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié) 果

AQP-4在各組家兔視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮均有表達(dá)，陽性表達(dá)主要見于面對視網(wǎng)膜血管的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞突起，見圖1～圖7。

與正常對照組相比較，AQP-4的表達(dá)在視網(wǎng)膜挫傷后1h組（t=9.407，P＜0.01）、3h組（t=6.653，P＜0.01）、24h組（t=7.249，P＜0.01）、3d組（t=4.556，P＜0.01）、7d組（t=3.724，P＜0.01）和14d組（t=2.268，P＜0.05）均明顯升高；視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮AQP-4表達(dá)在視網(wǎng)膜挫傷后也呈現(xiàn)動態(tài)變化：傷后1h組即高于對照組（t=9.407，P＜0.01），3h組明顯升高，24h組AQP-4表達(dá)最強(qiáng)，3d組AQP-4表達(dá)已經(jīng)明顯下降，挫傷后7d組表達(dá)下降更為明顯，14d組AQP-4表達(dá)仍高于正常對照組（t=2.268，P＜0.05）；各個挫傷組AQP-4表達(dá)也存在明顯差異（F=12.692，P＜0.05），見表1和圖8。

圖1 正常對照組 在神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層和內(nèi)核層可見散在的陽性細(xì)胞（SABC，×200）

圖2 傷后1h 在神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層和內(nèi)核層的陽性細(xì)胞數(shù)增多（SABC，×200）

圖3 傷后3h 在神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層和內(nèi)核層的陽性細(xì)胞數(shù)進(jìn)一步增多（SABC，×200）

圖4 傷后24h 在神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層和內(nèi)核層的陽性細(xì)胞數(shù)明顯增多（SABC，×200）

3 討 論

圖5 傷后3d 在神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層和內(nèi)核層的陽性細(xì)胞數(shù)減少（SABC，×200）

圖6 傷后7d 在神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層和內(nèi)核層的陽性細(xì)胞數(shù)明顯減少（SABC，×200）

圖7 傷后14d 在神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層和內(nèi)核層的陽性細(xì)胞數(shù)明顯減少，但是依然比正常組高（SABC，×200）

表1 視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層AQP-4表達(dá)（灰度值）

圖8 視網(wǎng)膜挫傷后視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層AQP-4表達(dá)動態(tài)變化

視網(wǎng)膜挫傷是導(dǎo)致眼外傷后視力喪失的主要原因之一，目前對視網(wǎng)膜挫傷后的臨床表現(xiàn)已經(jīng)有了較充分的認(rèn)識，但其發(fā)病機(jī)制并未完全明了，研究表明視網(wǎng)膜挫傷后會發(fā)生水腫，并且視網(wǎng)膜水腫是動態(tài)變化的[1]。

AQP-4在眼部有廣泛的分布，介導(dǎo)各種類型細(xì)胞膜的水轉(zhuǎn)運；AQP-4在視網(wǎng)膜上的表達(dá)最強(qiáng)，整個視網(wǎng)膜均可見 AQP-4陽性表達(dá)，特別是在外叢狀層、內(nèi)核層、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層AQP-4表達(dá)更明顯[3,5,6]。Hamann等[7]用免疫印跡、免疫電鏡證實 AQP-4主要表達(dá)于視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞，定量分析發(fā)現(xiàn)AQP-4在視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞足突膜較非足突膜有高濃度的表達(dá)。眼組織AQP-4的調(diào)節(jié)機(jī)制尚不十分清楚，早先認(rèn)為大多數(shù)AQP以固有的活性狀態(tài)存在于所分布的組織中，無需門控和調(diào)節(jié)，但后來很多實驗表明，在分子和基因水平還是存在著組織特異性調(diào)節(jié)，調(diào)節(jié)AQP的因素包括激素、神經(jīng)遞質(zhì)及細(xì)胞因子等[2,3,8-10]。本研究觀察到視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層有AQP-4表達(dá)，并且AQP-4的表達(dá)在視網(wǎng)膜挫傷后呈現(xiàn)動態(tài)變化：在挫傷后1h AQP-4表達(dá)升高，挫傷后3h AQP-4表達(dá)升高明顯，挫傷后24h AQP-4表達(dá)最強(qiáng)，挫傷后3d AQP-4表達(dá)較前明顯下降，挫傷7d后AQP-4表達(dá)下降更為明顯，但3d組和7d組AQP-4表達(dá)仍高于正常對照組；挫傷14d后AQP-4表達(dá)也未完全恢復(fù)正常；而先前的研究提示視網(wǎng)膜挫傷后視網(wǎng)膜會發(fā)生水腫，并且視網(wǎng)膜水腫也是動態(tài)變化的[1]；因此，推測挫傷后視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層AQP-4表達(dá)的動態(tài)變化和視網(wǎng)膜水腫的動態(tài)變化存在一定相關(guān)性。AQP-4在視網(wǎng)膜水腫中的變化是功能方面的作用，還是一種附帶現(xiàn)象，暫不能下定論。因此，AQP-4抑制劑的研發(fā)應(yīng)用非常有意義。AQP-4的作用可能是雙方面的，它可能導(dǎo)致視網(wǎng)膜水腫的形成和發(fā)展，也可能起到保護(hù)作用。因此，這又為我們臨床治療提供了新的線索。AQP-4是水分子向細(xì)胞外轉(zhuǎn)移的直接通路或載體[11]，是膠質(zhì)細(xì)胞和血管之間的水調(diào)節(jié)和運輸?shù)闹匾Y(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，以AQP-4作為治療的靶向，可能在防止視網(wǎng)膜水腫的發(fā)生發(fā)展具有一定的指導(dǎo)價值。目前對AQP-4與挫傷性視網(wǎng)膜水腫的研究還非常少，而臨床資料十分有限，這需要廣大學(xué)者共同去研究。

本研究僅僅是一個開端。在進(jìn)行圖像分析時，由于是任意選擇15個視野來估計陽性表達(dá)細(xì)胞的灰度值，這樣也會造成很大的差別，對實驗結(jié)果也會有影響。因此，本研究還將進(jìn)一步探討AQP-4在視網(wǎng)膜挫傷發(fā)病機(jī)制上的意義。

[1]付群,王志玉.實驗性兔視網(wǎng)膜挫傷后不同時段的視網(wǎng)膜厚度研究[J].臨床眼科雜志,2008,16(3):262-264.

[2]寧巧明,王祥瑞.水通道蛋白的研究進(jìn)展[J].國外醫(yī)學(xué)泌尿系統(tǒng)分冊,2005,26(5):271-272.

[3]徐春玲,宋躍.眼與水通道蛋白的研究進(jìn)展[J].眼科新進(jìn)展,2001,21(2):130-133.

[4]王志玉,付群,史愛云.視網(wǎng)膜挫傷后神經(jīng)感覺層細(xì)胞凋亡的實驗研究[J].眼科新進(jìn)展,2008,28(8):590-594.

[5]Sipperley JQ,Quigley HA,Hass JDM. Traumatic Retinopathy of Prematurity in Primates the explanation of commotio retinae[J].Arch Ophthalmol,1998,96(12):2267-2273.

[6]Hiroaki Y,Tani K,Kamegawa A,et al. Implications of the Aquaporin-4 Structure on Array Formation and Cell Adhesion[J]. J Mol Biol,2006,355(4): 628-639.

[7]Hamann S,Zeuthen T,La CM,et al. Aquaporins in complex tissue:distribution of aquaporins 1-5 in human and tar eye[J]. Am J Physiol,1998,272(Cell Physiology,43):C1332.

[8]Li J,Patil RV,Verkman AS. Mildly Abnormal Retinal Fuction in Transgenic Mice without Muller Cell Aquaporin-4 Water Channels[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,2002,43(2): 573-578.

[9]Da T,Verkman AS. Aquaporin-4 Gene Disruption in Mice Protects against Impaired Retinal Function and Cell Death[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci,2004,45(12):4477-4481.

[10]李莉,葛堅.水通道蛋白與眼病[J].國外醫(yī)學(xué)眼科學(xué)分冊,2001,25(2):69-73.

[11]崔向?qū)?伊嶺.水通道蛋白4在大鼠創(chuàng)傷性腦水腫中的作用機(jī)制[J].中國康復(fù)理論與實踐,2005,11(9):720-722.