養殖江團體色改變的生化分析

陶青燕 張勇 李鑫 羅國強

從2002年起，各類無鱗魚體色改變的現象在水產養殖行業呈不斷高發的趨勢，一方面由于其發病迅速，明顯而迅速成為人們關注的熱點；另一方面，由于其發病規律性較差，難于復制等特征，目前還未確定出其致病因子的分類。變色魚的主要特征為黑色素的丟失，并因魚的品種不同而表現出各種奇異的體色。由于變色魚從視覺上難以被消費者接受，從而給水產養殖，特別是特種水產養殖帶來巨大的經濟損失。目前關于養殖魚體體色改變的原因還不甚清楚，其系統的研究僅見于變色魚鱗片黑色素細胞的顯微觀察分析，而對于生產中變色頻率最高的無磷魚體色改變的生化研究還尚未見開展。江團學名長吻鮠，是我國特有的優良無鱗魚品種，具有肉質鮮美，經濟價值高的特性。本研究擬采集變色江團和正常體色江團就可能影響黑色素形成的相關因子進行比較研究，以探討引起無鱗魚體色改變的內在生化機制。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

在成都周邊漁場購買體重為250 g左右的健康江團以及正處于體色異常階段的變色江團各5尾。其中變色江團體表黑色素部分脫落，呈斑塊狀，正常江團體表色素分布均勻，自然，呈灰白色。

1.2 樣品采集

分別于尾靜脈處取各試魚的血液3 ml，4℃離心（3000 r/min,10 min）取血清，-20℃下保存待用。取各試魚肝胰臟，冰浴勻漿后放入液氮中保存待用。用手術刀取魚體背鰭后側背中線附近2×2 cm2的皮膚及魚體右側腹鰭后側2×2 cm2側的皮膚。魚皮剝離肌肉后，按照1：10(W/V)溶于pH值7.4冷的0.1 M的PBS緩沖液中冰浴勻漿，4℃培養3～12 h,在4℃下，12000 r/min,離心30 min，取得上清液，得到皮膚抽提液，凍存于-70℃備用。

1.3 指標測定

肝臟中總蛋白含量的測定采用考馬斯亮蘭法試劑盒（天根生化科技公司生產）；肝臟中還原型谷胱甘肽（GSH）的測定參見還原型谷胱甘肽試劑盒操作方法（南京建成生物工程研究所生產）；血清丙二醛（MDA）的測定參見MDA試劑盒操作方法（南京建成生物工程研究所生產）；血清銅藍蛋白的測定參見銅藍蛋白試劑盒操作方法（南京建成生物工程研究所生產）。

酪氨酸酶活性分析參照Zhang等(2000)[1]的方法進行。酶的活力單位（unit）規定為，在試驗條件下，每分鐘每毫克蛋白OD值增加0.001規定為一個酶活力單位。抽提液中蛋白濃度的測定同肝蛋白。

1.4 數據分析

試驗數據采用SPSS軟件進行統計分析，結果用平均數±標準差表示，并用T-Test進行顯著性檢驗。

2 結果與分析（見表1、表2、表3）

表1 正常及變色江團肝臟蛋白、肝臟GSH的含量

從表1可以看到，正常組肝蛋白的含量顯著高于變色組（P＜0.05）,而正常組肝中GSH含量顯著低于變色組（P＜0.05）。

表2 正常及變色江團血清銅藍蛋白及MDA含量

從表2可以看出，正常組血清中銅藍蛋白的含量與變色組之間不存在顯著的差異，但變色組血清中MDA的含量極顯著的高于對照組（P＜0.01）。

表3 正常及變色江團皮膚酪氨酸酶活性

從表3中可以看出，正常及變色江團皮膚中酪氨酸酶的活性存在顯著差異，同一部位正常組明顯高于變色組，其背鰭后沿和腹鰭后沿皮膚處的酶活力均為變色組的3倍。

3 討論

我們在生產實踐中發現銅離子在治療無鱗魚的變色方面表現出不穩定的療效，而銅是酪氨酸酶的輔基，對于黑色素的形成具有重要作用，因此，無鱗魚體色的改變是否是由銅缺乏引起的，目前還未見報道。但本試驗結果表明，正常江團與變色江團的血清銅藍蛋白的含量之間不存在顯著差異，并且銅離子廣泛存在于養殖水體中。在常規養殖條件下，未見魚體銅缺乏癥的發生。這就基本排除了魚體因銅缺乏導致黑色素合成障礙的可能性。

已知MDA是脂質過氧化的最終分解產物之一，其含量能直接反映機體脂質過氧化程度，并間接反映細胞損傷程度。而GSH作為機體重要的抗氧化防御物質，在機體處于高氧化應激狀態時能代償性的升高[2]。從本試驗結果可以看出，變色魚體內MDA的含量極顯著的高于對照組，并且變色魚肝臟中GSH含量的代謝性增高以及肝臟蛋白質含量的下降均與實驗室條件下氧化損傷的生化改變相一致。早在1974年Murai[3]等就觀察到氧化魚油可使斑點叉尾鮰的皮膚色澤變淺，即氧化油脂可以影響黑色素的代謝。但整體皮膚顏色的變淺與局部或整體皮膚黑色素的丟失是否是同一問題的不同表現形式目前還尚不清楚。

已知皮膚黑色素代謝的異常可能是來源于合成功能的抑制或降解功能的亢進。在本研究中發現，變色魚相對于正常魚其皮膚中色素合成的關鍵酶活性顯著下降，這與葉元土等（2006）[4]觀察到變色魚鱗片中出現大量黑色素細胞凋亡的現象相吻合。

目前尚有不少水產工作者認為，變色魚僅在皮膚有病理變化而對魚體沒有損傷，從本試驗結果可以看出，變色魚肝臟蛋白的含量顯著的低于正常組，表明肝臟存在嚴重的損傷。同時在臨床上可以看到部分變色魚的肝臟呈豆腐渣樣，并且魚體體表有比較嚴重的出血現象，若未及時治療，病程較長的池塘也會出現大規模的死亡。

在近年來的分析討論中，不少研究者將牙鲆等海水魚的白化與無鱗魚的體色改變在一定程度上劃了等號。但在我們的研究及實踐中發現，這兩者之間是存在較大差異的。雖然同為皮膚色素異常，但鲆類的白化往往發生在幼魚階段，其發病過程可能涉及細胞的分化，并且這種病理改變往往是不可逆的，相對于正常皮膚，白化的皮膚往往具有更高的酪氨酸酶活性[5]。而近年來多發的無鱗魚變色可發生于養殖魚類的各個階段，并且在生產實踐中表現出明顯的可逆性，其黑色素的減少與皮膚中酪氨酸酶活性降低直接相關。因此，用鲆類白化的研究成果來分析無鱗魚的變色可能是欠妥的。

4 結論

本研究結果表明，變色江團相對于正常江團體內銅水平正常，變色江團存在嚴重的氧化損傷，具體表現為血漿MDA水平的上升和GSH的代償性升高，而變色江團皮膚酪氨酸酶活性的顯著下降并導致黑色素合成抑制是導致變色江團皮膚黑色素丟失的直接生化原因。

[1]Zhang S C,Li G R..Presence of phenoloxidase and prophenoloxidase in epidermal cells and the epidermis mucus of the lancelet branchiostoma belcheritsingtauense[J].OPHELIA,2005,2(3):207-212.

[2]黃凱，阮棟儉，戰歌，等.氧化油脂對奧尼羅非魚生長和抗氧化性能的影響[J].淡水漁業,2006,36（6）：21－24.

[3]Murai T,Andrews J W.Interactions of dietary a-tocopherol,oxidized menhaden oil and ethoxyquin on channel catfish(Ictalurus punctatus)[J].J.Nutr.,1974,104:1416-1431.

[4]葉元土,郭建林,蕭培珍,等.養殖武昌魚體色與鱗片黑色素細胞初步觀察[J].飼料工業,2006（22）.

[5]黃冰.大菱鲆白化病白化機理研究[D].中國海洋大學，2006.