山東省1例人粒細胞無形體病的確認與調查*

李 忠,丁淑軍,呂 慧,陳 勇,侯配強,王顯軍

人粒細胞無形體病(Human granulocytic anaplasmosis,HGA)是由嗜吞噬細胞無形體侵染人末梢血中性粒細胞引起,以發熱伴白細胞、血小板減少和多臟器功能損害為主要臨床表現的蜱傳人畜共患傳染性疾病〔1-2〕。該病呈世界分布,但報道主要來自歐美地區〔3-4〕。近年分子生物學證據及血清學證據都證實亞洲許多國家包括日本、韓國以及我國存在有該病〔5-6〕。2006年我國安徽省首次發生院內無形體傳播感染事件〔7〕。在一項針對我國天津地區高危人群的調查結果顯示,我國農牧區從事農作物生產及畜牧業養殖人群無形體血清流行率達8.8%〔8〕。2008年5月下旬,我中心對泰安市疾控中心報告的1例不明原因發熱、伴白細胞和血小板減少病例進行了流行病學調查,并采集其血液標本開展了實驗室檢測,結果如下。

1 病例發現經過與治療

患者 xxx,女,41歲,漢族,泰安市新泰人。2008年5月11日不明原因開始出現發熱,最高達40℃,全身乏力。在當地醫院使用替硝唑、左氧氟沙星、阿奇霉素等藥物治療,用藥后第4d出現嘔吐,遂到泰安市某醫院就診,給予對癥處理。5月18日7:00pm,突然出現昏迷,入住當地某醫院。5月19日中午轉到泰安市中心醫院以“系統性紅斑狼瘡”收住院。入院診斷:“系統性紅斑狼瘡?、狼瘡性腦病?、血液系統損害、腎損害”。入院時神志淡漠,煩躁,呈現昏迷狀態。入院后血常規檢查:白細胞(1.95×109/L)和血小板(84×109/L)減少;尿蛋白陽性;轉氨酶升高;心肌酶譜升高。骨髓涂片示增生活躍,粒系增生,部分粒細胞漿中可見多少不一的粗大紫紅色顆粒及空泡。血涂片示白細胞數減少,粒細胞比例減低,可見異型淋巴細胞。血小板散在可見。臨床上排除了常見發熱疾病后,考慮到患者發熱,白細胞、血小板同時降低,且肝功轉氨酶升高,根據衛生部2008年初下發的《人粒細胞無形體病預防控制技術指南(試行)》,中心醫院診斷為人粒細胞無形體病疑似病例,為求進一步明確診斷,邀請省衛生廳組織臨床和疾控專家會診。入院后經醫院補液、應用頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉、左氧氟沙星、復方甘露醇等治療不見好轉,仍高燒不退、病情加重;會診后,使用強力霉素等抗立克次體感染藥物以及補液、輸血、物理降溫等對癥治療后,神志轉清,口齒逐漸清晰,40余天后痊愈出院。

2 流行病學調查

患者所在的村為一自然村,100多戶人家,340-350人,以農作物種植、養蠶為主要收入來源,屬于丘陵地帶。平日在家務農,有20余畝地,種植有花生、核桃、地瓜、楊樹等農作物。院子門口有野草,屋后為莊稼地。家中飼養2只狗,1只羊,在其中1只狗和羊身上發現有蜱,狗在屋后莊稼地里飼養,狗身上發現眾多蜱寄生,捕獲后初步鑒定為硬蜱。患者家居住在村西南邊,家中衛生條件一般。發病前無外出史。臨床考慮為人粒細胞無形體感染后,追問有無蜱叮咬史,但患者自述發病前無蜱叮咬史。

3 實驗室檢測

無菌采集患者發病早期非抗凝血液標本以及EDTA抗凝血標本各3～5ml,血清分離后與抗凝血一同置-20℃保存作PCR檢測和核酸序列測定分析。PCR試劑盒(Taq聚合酶、dNTP、Buffer和DNA ladder)均購自大連寶生物工程有限公司,有效期內使用。PCR儀為Biorad公司產品。PCR陽性對照由中國疾病預防控制中心傳染病防制所立克次體室張麗娟老師惠贈。實驗引物針對無形體16S rRNA基因設計。外引物Eh-out1(AF414399)序列:5'-TTG AGA GTT TGA TCC TGG CTC AGA ACG-3';Eh-out2(AF414399)序列:5'-CAC CTC TAC ACT AGG AAT TCC GCT ATC-3';內引物HGA1和HGA2是無形體特異性引物,HGA1序列:5'-GTC GAA CGG ATT AT T CT T TAT AGC T TG-3';HGA2序列:5'-TAT AGG TAC CGT CAT TAT CTT CCC TAC-3'。外引物擴增片斷長度為653bp,內引物擴增片段長度為389 bp。DNA提取采用Qiagen公司生產的 DNA Blood Mini Kit對病例的抗凝血標本提取模板DNA,具體步驟參見操作說明書,最后采用AE緩沖液50μL抽濾以提高回收的 DNA濃度。套式PCR第一輪PCR反應:反應體系為25ul,其中buffer 2.5μL,dNT P 2μL,Eh-out1 和 Eh-out2 各 1μL,TaqE 0.125μL,DNA 模板 3μL,余用蒸餾水補足。反應條件第一輪94℃預變性5min,94℃變性45sec,55℃退火 50sec,72℃延伸1min,共40個循環,最后72℃總延伸5min。第二輪PCR反應取第一輪擴增產物1μL,HGA1和 HGA2引物各 1μL,其余反應參數不變。采用1%瓊脂糖凝膠電泳第二次PCR擴增產物,凝膠成像系統拍照。

取第二次PCR擴增產物50μL送Invitrogen公司作核酸序列測定分析。通過Internet網進入美國國家生物技術信息中心(www.ncbi.nlm.nih.gov)站點后,利用“BLAST”工具,與GenBank中注冊的HGA基因序列進行同源性比較。

4 結 果

4.1 臨床化驗檢查 血常規:白細胞波動在1.95×109/L～2.73×109/L之間,治療后,白細胞上升到6.15×109/L;血小板波動在34×109/L～84×109/L之間;血紅蛋白波動在64g/L～112g/L。谷丙轉氨酶最高達 284U/L,谷草轉氨酶最高達969U/L,總蛋白最低為 57.9g/L、白蛋白最低為27.4g/L。肌酸激酶最高為1276U/L,肌酸激酶同工酶58U/L,乳酸脫氫酶989IU/L,α-羥丁酸脫氫酶807IU/L,均升高。腎功檢測包括尿素(5.16mmol/L)及肌酐(105umol/L)均正常,尿蛋白 1.0/L。腰椎穿刺檢查:腦脊液壓力高,糖、蛋白、氯化物均高,未查見隱球菌及抗酸桿菌。血淀粉酶升高(605U/L)。

4.2 PCR電泳 以病人血液標本提取的DNA為模板,行套式PCR。瓊脂糖電泳結果顯示,PCR擴增產物約400bp大小,與陽性對照一致,見圖1。

4.3 序列分析結果 將第二輪PCR產物進行序列測定,見圖2,并將所獲得序列提交到GenBank,序列號為Gu908492。測定結果輸入BLAST分析工具,進行同源性比較。結果發現擴增片段與我國已報道的從浙江、吉林鼠中擴增的相對應序列(基因注冊號為DQ458808、DQ449948)相差1個堿基,同源性為99.7%,變異發生在117位堿基。根據衛生部《人粒細胞無形體病診療方案(試行)》,全血或血細胞標本PCR檢測嗜吞噬細胞無形體特異性核酸陽性,且序列分析證實與嗜吞噬細胞無形體的同源性達99%以上,是確診無形體病的主要實驗室依據之一。

圖1 PCR電泳結果1:DL2000 Marker;2:陰性對照;3:血標本;4:陽性對照;5:DL2000 M arkerFig.1 Electrophoresis of PCR products1:DL2000 marker;2:negative control;3:Blood sample;4:Positive control;5:DL2000 Marker

圖2 PCR產物測序圖譜Fig.2 Sequencingmap of PCR product

5 討 論

患者為中年女性,居住丘陵地帶,家中飼養的狗、羊身上以及周圍環境中發現有蜱生存,衛生條件較差,存在被蜱叮咬的可能性,有流行病學接觸史。患者發病急,以發熱、乏力等非特異癥狀為臨床首發表現,常規用藥效果不佳,且病情進展比較快,很快出現昏迷等神經系統癥狀。臨床化驗室檢查,血常規檢測發病早期白細胞、血小板數均低于正常范圍,為無形體病早期診斷指標;肝功指標顯示谷丙轉氨酶最高達284U/L,谷草轉氨酶最高達969U/L,均遠遠高于正常值4倍以上,同時總蛋白、白蛋白均降低,指示肝功能受損;心功能指標肌酸激酶最高為1276U/L,肌酸激酶同工酶58U/L,均高于正常范圍,提示心功能亦受累及。腎功檢測指標尿素及肌酐雖正常,但尿蛋白陽性,為1.0/L,提示腎功能亦有改變。腰椎穿刺時,腦脊液壓力高,糖、蛋白、氯化物均高,支持中樞神經系統感染,但未查見隱球菌及抗酸桿菌,排除了常見的隱球菌性腦膜炎和結核性腦膜炎。血淀粉酶605U/L,較正常值升高,提示胰腺功能改變。多項實驗室檢測顯示該病例合并有肝、腎、心、神經系統多器官、多系統功能損害。采其抗凝血進行套式PCR檢測,無形體核酸檢測陽性,且經測序證實與無形體同源性在99%以上,從病原學上亦得到了支持的證據。該病例有流行病學接觸史,臨床上有發熱、乏力等表現,實驗室檢測有白細胞、血小板降低,肝功轉氨酶明顯升高,病原學HGA核酸檢測陽性,且經測序證實。根據衛生部《人粒細胞無形體病預防控制技術指南(試行)》的診斷標準,該病例為人粒細胞無形體確診病例。

自1994年美國報告首例人粒細胞無形體病病例以來〔1〕,美國每年報告的病例約600～800人。目前美國多個州和歐洲多個國家都報導有人粒細胞埃立克體感染存在的證據。1999年以來高東旗等〔9〕報道從新疆的全溝硬蜱擴增出人粒細胞埃立克體(2003年后國際統一命名為人粒細胞無形體)特異性DNA片段;2001年,高東旗等〔10〕又從內蒙古大興安嶺采集的發熱病人血中擴增出人粒細胞埃立克體16S rRNA,說明我國存在著HGA感染病例。該病為一新發傳染病,目前對該疾病的病原學、發病機制、傳播途徑、臨床表現及治療方面的認識尚不足,臨床上容易誤診為其他發熱性疾病。如果不能及時明確診斷,由于該病病情進展比較快,往往造成病人多器官受累,增加死亡率。因此,加強該病的臨床診治水平及疾病檢測能力具有重要的現實意義。

感謝中美新發傳染病合作項目(No.1U2GGH000018-01)的技術支持,感謝泰安市疾控中心、新泰市疾控中心參與調查并對該調查給予大力支持!

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