章 瑩,蔡國斌,何 立,蔣明森

谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GPx)是生物體內廣泛存在的一種重要的過氧化物分解酶,以谷胱甘肽作為還原劑催化還原H2O2、有機氫過氧化物和脂氫過氧化物等活性氧分子(ROS)〔1〕,從而保護細胞膜的結構及功能不受過氧化物的干擾及損害,對維持細胞膜結構的完整性具有重要的意義。迄今發現GPx是一個至少包含6種不同同工酶(isoenzyme)的大型酶家族,包括經典/胞漿型谷胱甘肽過氧化物酶(GPx1/c-GPx)、胃腸型谷胱甘肽過氧化物酶(GPx2/GPx-GI)、血漿型谷胱甘肽過氧化物酶(GPx3/p-GPx)、磷脂氫谷胱甘肽過氧化物酶(GPx4/PHGPx)、附睪特異性谷胱甘肽過氧化物酶(GPx5/e-GPx)和氣味代謝谷胱甘肽過氧化物酶(GPx6/o-GPx)。其中PHGPx被認為是一種獨特的抗氧化酶,能直接保護生物膜免受過氧化損傷〔2〕。Cookson等(1992)和 Zelck 等(2004)認為GPx在感染性寄生蟲中是組成酶防御系統的主要前線,以確保它們暴露在宿主代謝產生的有害ROS環境中得以生存〔3-4〕。

本文旨在通過網絡資源,搜尋到包括幾種重要醫學吸蟲在內的不同生物GPx的cDNA、基因組DNA序列,然后通過生物信息學和比較基因組學方法,分析吸蟲GPx基因及其所編碼蛋白的分子特性、探討吸蟲GPx與其他生物體GPx的相關性,以及吸蟲GPx在生物系統發育中的進化地位等。

1 材料與方法

1.1 醫學吸蟲GPx的cDNA(包括EST)和基因組DNA序列檢索 以華支睪吸蟲(Clonorchis sinensis)PHGPx1 cDNA序列(EF056481)作為查詢詞(query)用于BLASTx,獲得從GenBank數據庫中已注冊的吸蟲GPx序列。然后,為了獲得更多常見寄生性吸蟲GPx的核酸序列,一些常用的寄生蟲學專業的基因組或EST數據庫用來作進一步的檢索:如Sanger institute配備的數據庫網站http://www.sanger.ac.uk/Projects/Helminths可檢索曼氏血吸蟲(Schistosoma mansoni)、埃及血吸蟲(S.haematobium)、肝片形吸蟲(Fasciola hepatica)等的序列;上海生命科學和生物技術信息中心配備的日本血吸蟲數據庫(Shanghai Center for Life Science and Biotechnology Information,http://lifecenter.sgst.cn/sj.do)可檢索日本血吸蟲(S.japonicum)的序列等。

1.2 6大GPx家族DNA和氨基酸序列的檢索以華支睪吸蟲PHGPx1氨基酸序列(ABK58679)作為query進行BLASTP,獲得從GenBank數據庫中的許多相近GPx序列。此外,人 c-GPx/GPx1(CAA68491)和p-GPx/GPx3(AAP50261)以及線蟲Brugia pahangi GPx3(CAA48882)也用來進行BLASTP以獲得其他家族的GPx氨基酸和DNA序列。考慮到相似值和分類學上的分布,共107個成員(分別處在不同GPx家族和不同等級生物體)的氨基酸或cDNA序列用來作生物信息學分析。

1.3 一般生物信息學分析 cDNA序列所編碼的開放閱讀框(ORF)和同源性分析用美國生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI:http://www.ncbi.nlm.nih.gov)網站下的ORF Finder和基本局部比對搜索工具(basic local alignment searvh tool,BLAST)進行分析。使用SECISearch程序(版本2.19,http://genome.unl.edu/SECISearch.html)推測 cDNA 3'-端非翻譯區(3'-UT R)是否含有硒半胱氨酸插入序列(selenocysteine insertion sequence,SECIS)。利用SignalP程序(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)推測所編碼的蛋白質是否含有疏水信號肽,和用ScanSite pI/Mw程序(http://scansite.mit.edu/calc_mw_pi.html)計算理論分子量(Mr)和等電點值(pI)。

1.4 氨基酸序列比對(Amino acid sequence alignment)和系統進化樹(Phylogenetic tree)分析 根據相似值和分類學上的分布,各家族成員的氨基酸先用ClustalX工具進行對比,然后用GeneDoc程序優化。首先對所有檢索到的醫學吸蟲GPx序列進行比對,并計算所檢測序列的相似值。然后對所有6大GPx家族成員進行比對,并用PHYLIP工具包(版本,ver 3.6b)中的 PROTPARS程序、或NEIGHBOR程序通過最大簡約法則(maximum parsimony algorithm,MP)、或鄰近歸并聚類法則(又名鄰接法則,neighbor-joining algorithm,NJ)進行系統學分析。系統樹用 TreeView顯示,每個分支上的數值用100個隨機樣品作為輸入序列、通過SEQBOOT程序算出有統計意義的數值。

1.5 比較基因組學分析 從基因組和/或EST數據庫,利用網絡資源檢索獲得各分類學上不同位置GPx代表成員的cDNA和基因組DNA,通過比較它們之間的堿基序列,得到各成員的基因結構:包括外顯子(exon)和內含子(intron)的數量、外顯子和內含子的序列長度以及內含子的剪接插入位置(intron phase)。然后進行比較基因組學分析,探討醫學吸蟲GPx基因家族在分類學上的進化關系。

2 結 果

2.1 醫學吸蟲GPx序列分析、及與其他GPx家族氨基酸比對分析 通過檢索,共獲得吸蟲 12個GPx序列,包括華支睪吸蟲(Cs)4個、衛氏并殖吸蟲(P.westermani,Pw)2個、曼氏血吸蟲(Sm)2個、日本血吸蟲(Sj)2個、埃及血吸蟲(Sh)1個和肝片形吸蟲(Fh)1個。各序列分別設定為:CsGPx1(EF056481)、CsGPx2(EF056482)、CsGPx3(EF056483)、CsGPx4(EF056484)、PwGPx1(DQ454159)、PwGPx2(DQ454160)、SmGPx1(L37762)、SmGPx2(AY729668)、SjGPx1(CV689936)、SjGPx2(AY223160)、ShGPx1(Shaem32f07.q1k)和FhGPx1(Fhep45e11.q1k)。各基因編碼的氨基酸序列所預測的理論分子量均為20 kDa左右,部分基因N-末端含有疏水信號肽序列(圖1中5'-端底劃線處)。各氨基酸序列之間具很高的相似度,尤其在活性區高度保守。GeneDoc程序檢測的這些吸蟲GPx基因的氨基酸序列同一性值從35%到87%,如表1。

表1 寄生性吸蟲GPx基因編碼的氨基酸之間的同源性值(%)Tab.1 Identities of the GPXs from different parasitic trematodeds

吸蟲GPx與哺乳動物宿主人(Homo sapiens,Hs)和鼠(Musmusculus,Mm)6大GPx家族成員氨基酸序列比對結果如圖1所示。從圖中可見:各家族之間具有較高的同源性,尤其在3個特征區域(即酶活性區,圖中方框A、B和C)和3個保守活性殘基(圖中箭頭所示,硒半胱氨酸(U或X)/半胱氨酸(C)、谷氨酰胺(Q)、色氨酸(W)/酪氨酸(Y))具有高度的保守性,非常相似。此外,比對圖也顯示,有2個區域僅存在于GPx1(c-GPx),GPx2(GPx-GI),GPx3(p-GPx),GPx5(e-GPx)和GPx6(o-GPx)家族,而在GPx4(PHGPx)家族的成員中缺失(圖2中用虛線盒I和II表示)。吸蟲GPx氨基酸一級結構中缺失這2個插入序列,表明吸蟲GPx均屬于PHGPx家族成員。

2.2 醫學吸蟲GPx SECIS、及與其他GPx家族SECIS分析 在分析常見醫學吸蟲(包括華支睪吸蟲、衛氏并殖吸蟲、日本血吸蟲、曼氏血吸蟲、埃及血吸蟲和肝片形吸蟲等)12個GPx核酸序列是否存在硒半胱氨酸(Sec)和SECIS時發現,除PwGPx1外,其他11個基因在其開放閱讀框內均含有一非尋常“TGA”密碼子,編碼第21個稀有氨基酸Sec(見圖1,U),同時在這些基因的cDNA 3'-UTR均含有相對應的SECIS區(如圖2B,Trematode GPx)。在其他GPx4家族成員中,Sec和相關SECIS序列僅發現在哺乳動物宿主的mRNA序列中存在,而在被檢測的節肢動物中,僅發現一種牛蜱(Boophilus)GPx4(ABA25916)含有Sec和SECIS。其他節肢動物和所有植物中PHGPx均無Sec和SECIS結構。而GPx1,GPx2,GPx3家族僅高等哺乳動物有此特征。所有這些GPx基因的SECIS均含有幾個保守的結構域包括:由一個內環隔開的2個螺旋,一SECIS核心結構,一四集體位于第二個螺旋的基部和一個頂環等(圖2A)。

2.3 GPx家族系統發育樹分析 當用CsGPx1的氨基酸序列進行BALSTP同源性檢索時,幾百個GPx蛋白能從GenBankTM數據庫中獲得,它們與CsGPx1有不同程度的相似性(序列同源性identities值在44%～67%之間,E值小于4e-26)。但是,由于其中絕大部分蛋白質的氨基酸序列是PHGPx-樣蛋白,因而用人的GPx1(CAA68491)和GPx3(AAP50261)及線蟲CAA48882 GPx3-like再進行一次BLASTP搜索,即獲得更多其他GPx的成員信息。另外配備在Sanger和 TIGR的各種醫學蠕蟲的EST數據庫也用GPx1和GPx3及GPx4進行篩選,最后有選擇性地挑選一批代表各家族成員共107個進行系統發育樹分析。

系統發育樹所選擇的GPx成員包括從真菌(Fungi)、節肢動物(Arachnida)、醫學吸蟲(Trematoda)、營自生生活線蟲(Soil nematoda)、寄生性線蟲(Parasitic nematoda)、無脊椎動物(Invertebra-ta)、脊椎動物門(Vertebrata)和植物(Plant)等各分類層次代表。結果顯示:根據在生物學分類上不同的地位,各類生物的GPx均一般聚集在一起。迄今Fungi的GPx屬哪個家族不是很清楚,GenBank數據庫中有的認為是PHGPx家族,有的沒有具體分類。包括人和鼠等高等脊椎動物的GPx被分為至少6大家族,而且發現每個基因在其基因組內均以單拷貝形式存在。在較低等的動物中,GPx蛋白存在明顯的偏向分布:除蛛形綱(Arachnida)的Ixodes scapulans(AAY66814)外,其他節肢動物、吸蟲以及植物等的GPxs蛋白與脊椎動物(包括哺乳動物和人)的PHGPx分布在同一分枝,具有同源性。線蟲的GPx基因具有較復雜的分布:Parasitic nematoda的GPx蛋白顯示與脊椎動物的GPx1/GPx3 lineage具有更相近的拓撲關系,而Soil nematoda中Caenorhabditiselegans有兩種情況,有些GPx分布在GPx3 lineage,有些分布在GPx4 lineage。此外,系統發育樹亦顯示:吸蟲和昆蟲的PHGPxs均單獨分成了兩個不同的亞類。如在吸蟲中,CsGPx2、SmGPx1、PwGPx1和PwGPx2被歸類在吸蟲I亞類 ,而 CsGPx1、CsGPx3、CsGPx4 與 SmGPx2 被歸類在吸蟲II亞類。

圖1 寄生性吸蟲GPx與哺乳動物宿主(人和鼠)6大GPx家族成員的氨基酸多重比對分析Fig.1 Multiple sequence alignment of parastic trematodes GPxs with members of six GPx families from Mammalian host(Homo sapiens and Musmusculus)

2.4 醫學吸蟲GPx基因結構及與其他GPx基因結構分析 通過網絡數據庫和信息學分析,共獲得8個吸蟲GPx基因的完整基因組結構,見圖3。除CsGPx4是由5個外顯子和4個內含子組成外,其他幾種吸蟲GPx基因均被5個內含子剪接為6個外顯子,且所有這些吸蟲GPx基因結構高度保守。

各吸蟲GPx與不同等級生物(包括高等脊椎動物、線蟲、昆蟲和植物)PHGPx的基因組結構比較結果如圖3所示:根據它們的內含子的數量和位置,各不同等級生物代表物種GPx4基因分享相對比較保守的基因組結構;外顯子—內含子的結構在吸蟲和哺乳動物宿主之間存在高度相似性。在吸蟲GPx基因的 5個內含子中,有 4個跟哺乳動物GPx4基因在位置和ORF剪接插入位置均相同(圖中橫線上數字所示);從營自由生活的線蟲C.elegans和C.briggsae分離的GPx4基因的第1個內含子跟吸蟲和哺乳動物的第2個內含子類似,具有一定程度的同源性;從昆蟲分離的PHGPx基因與吸蟲和脊椎動物的基因沒有顯示任何結構上的關系,反而與從植物分離的GPx基因存在某種程度的同源性。

圖2 寄生性吸蟲GPx與其他GPx家族相關成員mRNA中3'-UTR的SECIS分析Fig.2 Analysisof SECIS motif fromdifferent parastic trematodes and other related members of mRNA3'-UTR regions

圖3 寄生性吸蟲 GPx和其他相關PHGPx“外顯子-內含子”基因組結構比較分析Fig.3 Exon-intron structures analysis between the parastic trematode GPx genes and other related PHGPx genes from various organisms

3 討 論

在所有生物體中(包括細菌、植物和動物),GPx被認為是在抗-ROS防御機制中重要的關鍵酶〔2〕。PHGPx由于其不僅能降解H2O2,而且還能直接降解整合在細胞膜上的磷脂化合物,因而被認為是一種獨特的抗氧化酶〔5〕。本研究通過網絡資源,搜尋到多種重要醫學吸蟲GPx序列。通過氨基酸比對、系統發育樹和Sec/SECIS的分析,證明醫學吸蟲GPx分子均為PHGPx家族成員。一般認為PHGPx在其3個催化區域中,有一個位點含有Sec。Sec插入蛋白質的合成過程受其mRNA的框內UGA密碼子和它的下游鏈的莖-環(stem-loop)結構所控制,這種特殊的莖-環結構稱為硒半胱氨酸插入元件(SECIS)。在生物學上,把含有Sec的蛋白稱為硒蛋 白 (selenoprotein)〔6〕。分 析 發 現,吸 蟲 除PwGPx1基因外,其它均為含硒蛋白(如圖1和圖2)。不同生物體內,硒-依賴PHGPx(sPHGPx)和硒-非依賴PHGPx(siPHGPx)存在嚴重的偏向分布特征。圖2顯示,除一節肢動物Boophilus microplus外,僅在脊椎動物和吸蟲的PHGPx mRNA中檢測到含有Sec和SECIS序列。以往研究報道認為,sPHGPx比siPHGPx酶的活性要更高,其原因是由于在生理條件下sPHGPx(pKa=5.2)比siPHGPx(pKa≥8.0)更容易使還原狀態轉變為氧化狀態〔7〕。因此,siPHGPx酶可能存在另外的機制以一種新的方式發揮其在細胞內抗氧化的功能〔8〕。或者,也有可能siPHGPx作為抗氧化酶在特殊的細胞器中發揮作用,這些細胞器內可能受半胱氨酸的巰基基團離子能的作用,使得其有特殊的pH微環境。

在分析基因組結構時,內含子的獲得或丟失、以及內含子的數量和長度大小均可反應生物體之間的進化關系〔9〕。在吸蟲GPx基因中,內含子1、4和 5存在明顯的長度多態性現象。CsGPx1、CsGPx3、CsGPx4和SmGPx2的第5內含子(長度分別為6,768、2,960、4,851和 1,438bp)明顯地大于哺乳動物基因(如人CAA50793為 80bp,鼠 BAA22780為86bp);而 PwGPx1、PwGPx2、CsGPx2 和 SmGPx1的第1內含子(長度分別為 1,772、2,497、2,082和1,290bp)和第4內含子(長度分別為3,018、5,889、2,054和1,609bp)均明顯地大于哺乳動物基因(如人CAA50793為1,058和432bp,鼠BAA22780為798和803bp),因而吸蟲GPx基因分成了2亞類。總的來說,內含子的長度和數量還是展現出一定的規律,即與生物體基因組的復雜性相關〔10〕,并且這些延長的內含子是與轉座子插入有關〔11〕。在寄生性吸蟲基因組中,如存在最大長度多態性現象的CsGPx1和CsGPx2基因的第5內含子就整合了一非長末端重復序列反轉座子(non-LTR retrotransposons),其與曼氏血吸蟲的SR2非長末端重復序列反轉座子同源。PwGPx1和PwGPx2基因的第4個內含子也分別整合了一與曼氏血吸蟲的penelope-like LT R retrotransposon,Perere-10同源的反轉座子和一與曼氏血吸蟲non-LTR retrotransposon,Perere-6同源的非長末端重復序列反轉座子。

比較基因組學分析表明,吸蟲PHGPx基因結構與哺乳動物PHGPx具有更高的同源性(圖3),表明寄生蟲與宿主之間PHGPx基因可能是從共同的祖先基因逐漸進化而來,此基因含有6個外顯子和5個內含子。在進化過程中,哺乳動物PHGPx基因獲得一內含子,而吸蟲 PHGPx基因通過復制(duplication),然后形成分支(divergence)。第一分支(Trematode I)保留了祖先基因結構,而第5個內含子的長度得到延伸(如CsGPx2,PwGPx1,PwGPx2和SmGPx1)。第二分支(T rematode II)內含子1和內含子4的長度則變短(如CsGPx1,CsGPx3,CsGPx4和SmGPx2)。另外,在生物進化過程中,一些PHGPx基因在祖先基因的第1和第2外顯子之間丟失了1個內含子(如CsGPx4),而有些PHGPx基因保持了祖先基因的結構或者丟失了信號肽序列(如CsGPx3)。更復雜的分析包括昆蟲、線蟲和植物等在內的所有不同分類等級生物體的PHGPx基因的進化方式需更進一步的分析。

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