布魯菌病的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法

辛梅平 林瑞生 王 君

山東省安丘市疾病預(yù)防控制中心（262100）

布魯菌病的臨床表現(xiàn)不具特異性，其診斷必須依靠常規(guī)的細(xì)菌培養(yǎng)和（或）血清學(xué)方法檢測(cè)高水平的特異性抗體，但是有一定的局限性。國內(nèi)外學(xué)者將聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）應(yīng)用于布魯菌病研究的許多領(lǐng)域。為此，筆者將以上常用布魯菌病實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法進(jìn)行總結(jié)，以指導(dǎo)疾病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)在人群中開展疾病篩查和臨床診斷工作。

1 血液標(biāo)本細(xì)菌培養(yǎng)法

1.1 雙相培基培養(yǎng)法

在100mL三角燒瓶中盛20～30mL瓊脂培養(yǎng)基，滅菌，制成斜面，然后無菌加入10mL5%的枸櫞酸鈉，1%葡萄糖糖和經(jīng)113℃ 10min滅菌的1%甘油肉湯。無菌取血，加入雙相培養(yǎng)基的肉湯中，輕輕混合后傾斜，使被檢血液及肉湯很好地涂在瓊脂斜面上，置37℃溫箱中培養(yǎng)，3d后觀察結(jié)果。如未發(fā)現(xiàn)布魯菌生長(zhǎng)，可再傾斜，繼續(xù)培養(yǎng)觀察，如有可疑菌生長(zhǎng)，可轉(zhuǎn)種純培養(yǎng)，待進(jìn)一步鑒定。在3～4周未見可疑菌生長(zhǎng)，可停止培養(yǎng)，定為陰性。

1.2 感染未受精雞蛋法

取2個(gè)新鮮雞蛋，每個(gè)接種被檢血液0.2mL。把雞蛋放在固定架上，鈍端朝上，蛋殼用乙醇和碘酒消毒，然后用眼科手術(shù)刀在鈍端頂部中心穿1個(gè)小孔，用3cm長(zhǎng)的注射器針頭將被檢血液注入卵黃中，立即用滅菌石蠟將孔密封，置37℃溫箱中培養(yǎng)。5d后把接種雞卵無菌打開，用無菌的毛細(xì)管把接種血液部分的卵黃及蛋清吸出0.3～0.5mL轉(zhuǎn)種于培養(yǎng)基上，置37℃溫箱中培養(yǎng)，2～3d觀察1次，3～4周不見可疑菌生長(zhǎng)可停止培養(yǎng)。

2 常用的血清凝集反應(yīng)技術(shù)

2.1 平板凝集反應(yīng)

該反應(yīng)是一種操作簡(jiǎn)便、特異性強(qiáng)及敏感性高的診斷布魯菌病的方法。

2.1.1 操作方法

①取一潔凈的玻璃板，劃成12格（橫數(shù)6格，縱數(shù)2格），在第1列第2格標(biāo)明血清號(hào)碼。②用0.2mL吸管按第1格加0.08mL，第2加0.04mL，第3格加0.02mL，第4格加0.01mL的劑量加血清樣品。③加平板凝集反應(yīng)抗原0.03mL于各血清格中，然后由血清量最小的格混勻。④在另外2格內(nèi)1格加入0.03mL血清樣品（為血清對(duì)照），另1格加0.03mL抗原（為抗原對(duì)照），然后各加入0.03mL鹽水，混勻。⑤混勻后將玻璃板置于酒精燈火焰上，均勻加溫，使溫度達(dá)到30℃左右，在5min內(nèi)記錄反應(yīng)結(jié)果。

2.1.2 判斷標(biāo)準(zhǔn)

出現(xiàn)大的凝集片或小的粒狀物，液體完全透明，可判定為++++；有明顯的凝集片，液體幾乎完全透明，可判定為+++；有可見的凝集片，液體不完全透明，可判定為++；液體混濁，只有少量粒狀物，可判定為+；液體均勻混濁為陰性；血清對(duì)照與抗原對(duì)照應(yīng)不出現(xiàn)凝集。

2.1.3 診斷標(biāo)準(zhǔn)

人、馬、牛、鹿在0.02mL血清量出現(xiàn)++為陽性，在0.04mL血清量出現(xiàn)++為可疑。山羊、綿羊、豬、犬在0.04mL血清量出現(xiàn)++為陽性，在0.08mL血清量出現(xiàn)++為可疑。

平板凝集反應(yīng)是20世紀(jì)80年代前應(yīng)用最廣泛的人、畜布魯菌病血清學(xué)診斷方法，并作為初篩試驗(yàn)在畜間廣泛應(yīng)用。該項(xiàng)技術(shù)操作簡(jiǎn)便、快速，適于大面積的調(diào)查研究。但它的特異性遠(yuǎn)不如試管凝集試驗(yàn)和補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)，易出現(xiàn)假陽性結(jié)果。所以，該方法不適于做確診的可靠依據(jù)，多作為篩選檢查。

2.2 試管凝集反應(yīng)

試管管凝集反應(yīng)為半定量試驗(yàn)方法，常用已知細(xì)菌作為抗原液與一系列稀釋的受檢血清混合，保溫后觀察每管內(nèi)抗原凝集程度，通常以產(chǎn)生明顯凝集現(xiàn)象的最高稀釋度作為血清中抗體的效價(jià)或滴度。試驗(yàn)中，由于電解質(zhì)濃度和pH值不適當(dāng)?shù)仍颍梢鹂乖姆翘禺愋阅霈F(xiàn)假陽性反應(yīng)，因此必須設(shè)不加抗體的稀釋液作對(duì)照組。

2.2.1 操作方法

取小試管5～10只，放于試管架上。第1管加鹽水2.3mL，第2管不加，第3管到最后一管管各加0.5mL鹽水。然后，用1mL吸管取血清樣品0.2mL加入第1管中，混勻后吸1mL加入第2、3管各0.5mL，第3管混勻后再吸0.5mL加人第4管，以此類推到倒數(shù)第2管吸0.5mL棄掉。將試管凝集抗原充分混勻后，做10倍稀釋，然后從第2管開始每管加入0.5mL，加入抗原之后，血清的最終稀釋倍數(shù)為從第2管開始1∶25、1∶50、1∶100……l∶3200，第1管為血清對(duì)照，最后1管為抗原對(duì)照。然后充分混勻，放于37℃溫箱中18～20h后取出，在室溫下放置1～2h觀察結(jié)果。血清對(duì)照為清亮透明無沉淀，抗原對(duì)照為均勻混濁。在兩種對(duì)照管都成立的情況下，方可判定試驗(yàn)管，否則應(yīng)重做。

2.2.2 判斷標(biāo)準(zhǔn)

液體完全透明，菌體呈傘狀沉淀，可判定為++++；液體近于完全透明，菌體呈傘狀沉淀，可判定為+++；液體略微透明，菌體呈較薄鄒傘狀沉淀，可判定為++；液體不透明，管底有不很明顯的傘狀沉淀，可判定為+；液體不透明，無傘狀沉淀，可判定為-。

2.2.3 診斷標(biāo)準(zhǔn)

人及牛、馬等大家畜血清凝集價(jià)在1∶100（++）以上為陽性，1∶50（++）為可疑；綿羊、山羊、豬及犬等小家畜血清在1∶50（++）以上為陽性，1∶25（++）為可疑。

試管凝集反應(yīng)的敏感性很高。患者常于發(fā)熱的第1天起就開始出現(xiàn)抗體，處于潛伏期及隱性感染的患者亦可出現(xiàn)陽性結(jié)果。隨著體溫的升高和癥狀的出現(xiàn)，凝集價(jià)急劇上升，急性發(fā)病2～3周后，凝集效價(jià)已呈現(xiàn)明顯的陽性，因此可作早期診斷；若多次做凝集反應(yīng)試驗(yàn)，凝集價(jià)不斷上升，則診斷意義更大。高凝集價(jià)可保持1年之久，然后顯著下降，以后在4～5年或更長(zhǎng)時(shí)間凝集反應(yīng)呈陰性或保持起伏不定的凝集價(jià)，如復(fù)發(fā)，凝集價(jià)又升高，因此，此方法可用來判定疾病活動(dòng)與否。

血清凝集反應(yīng)技術(shù)中最重要的是試管凝集反應(yīng)，是比較穩(wěn)定、特異、具有較高敏感性的成熟方法。它具有國際公認(rèn)的標(biāo)化方法、標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)操作程序、標(biāo)準(zhǔn)血清、國際換算單位以及人、畜的診斷標(biāo)準(zhǔn)。

3 全血聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)

PCR又稱無細(xì)胞克隆或體外基因擴(kuò)增，是一種對(duì)特定的DNA片段在體外進(jìn)行快速擴(kuò)增的方法，具有特異、敏感、快速、簡(jiǎn)便、重復(fù)性好、易自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)，是分子生物學(xué)技術(shù)的一項(xiàng)突破。PCR技術(shù)模擬體內(nèi)DNA的自然復(fù)制過程，引物按照堿基配對(duì)原則與DNA模板互補(bǔ)結(jié)合，在DNA聚合酶的作用下，從引物開始合成與模板DNA互補(bǔ)的DNA鏈。經(jīng)變性、退火、延伸等一次循環(huán)，DNA鏈數(shù)量增加1倍。經(jīng)過數(shù)次循環(huán)后，使fg水平的模板DNA達(dá)到ng水平，再用電泳方法檢測(cè)擴(kuò)張的產(chǎn)物。

3.1 全血DNA的提取[1]

取EDTA抗凝血200μL，1200r/min離心5s，棄去上清，加200μL雙蒸餾水重懸沉淀，煮沸5min以裂解細(xì)胞核細(xì)胞核，12000r/min離心1min，取上清液10μL直接進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

3.2 引物[1,2]

引物是由編碼牛種布魯菌3lKD外膜蛋白基因設(shè)計(jì)，華美公司合成。

B15'-GCAGTCHGACGTTGCCTATT-3'

B25'-GTCTGAGGTGTTCACCCTT-3'B1-B2擴(kuò)增片段230bp

B35'-AGTCAGACGTTGCCTATTG-3'

B45'-GTGTTCAGCCTTGATATCG-3'

B3-B4擴(kuò)增片段330bp

B55'-TGGCTCGGTTGCCAATATTCAA-3'

B65'-CGCGCTTGCCTTTCAGGTCTG-3'

B5-B6擴(kuò)增片段223bp

3.3 操作方法[2]

見表1。

表1 PCR實(shí)驗(yàn)加樣方法

94℃作用5min進(jìn)入循環(huán)，94℃變性1min，62℃退火1min，72℃延伸1min，引物B1和B2實(shí)驗(yàn)組行40個(gè)循環(huán)、B3和B4實(shí)驗(yàn)組行30個(gè)循環(huán)、B5和B6實(shí)驗(yàn)組行36個(gè)循環(huán)，最后一個(gè)循環(huán)結(jié)束，72℃延伸5min。PCB擴(kuò)增完畢，加載樣緩沖液5μL，混勻。取8μL在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳1h，EB染色，紫外檢測(cè)儀觀察結(jié)果。

文獻(xiàn)[1,2]研究發(fā)現(xiàn)，B1-B2和B3-B4兩對(duì)引物敏感性高、特異性好，且穩(wěn)定；而B5-B6結(jié)果不穩(wěn)定。所以，B1-B2和B3-B4兩對(duì)引物可以用于診斷布魯菌病，B5-B6仍有待于進(jìn)一步探討和證實(shí)。布魯菌病有復(fù)發(fā)的傾向，用常規(guī)方法診斷比較困難，而PCR技術(shù)可用于該類病例隨訪和診斷的方法。因此，PCR技術(shù)用于診斷布魯菌病有著廣闊的應(yīng)用前景。

[1] 王季秋,李鐵鋒,張貴珍,等.全血聚合酶鏈反應(yīng)試驗(yàn)在診斷布氏菌病中的應(yīng)用觀察[J].中國地方病防治雜志,2003,18(1):10-12.