Id1在肝細胞癌中的表達及其與癌細胞分化程度的相關性分析

許 政 夏秀娟 劉小方

煙臺毓璜頂醫(yī)院肝膽外科（264000）

肝細胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是最常見的消化系惡性腫瘤之一，在我國其病死率居惡性腫瘤死因的第二位，占全球肝癌死亡人數(shù)的近一半[1]。臨床實踐證明，早期肝癌的預后明顯優(yōu)于中晚期肝癌，而目前臨床常用的診斷方法如監(jiān)測甲胎蛋白、超聲、CT和磁共振成像(MRI)等，在肝癌早期診斷中仍顯不足，易造成早期肝癌的漏診與誤診；隨著分子生物學理論和技術的飛速發(fā)展，尋找新的早期肝癌診斷的腫瘤標志物以提高肝癌的早期診斷率已成為研究熱點。分化抑制蛋白（inhibitor of differentiation or inhibitor of DNA binding）簡稱Id蛋白。Id1是Id蛋白的一種，屬于螺旋-環(huán)-螺旋轉錄因子家屬成員之一，Id1蛋白具有Id類蛋白的功能，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、腫瘤血管生成有密切關系。Id1在目前已檢測的大部分腫瘤組織中均有明顯表達，而且基本和癌組織的惡性程度呈正比。

我們的前期研究顯示，在前列腺癌中Id1表達也與細胞惡性程度呈正比[2]。而日本學者報道HCC組織中Id1表達和前述不一致[3]，HCC組織中Id1表達與腫瘤細胞惡性程度呈反比，我國目前尚缺乏這方面的研究報道。我國是原發(fā)性HCC的高發(fā)區(qū)，早期檢測和治療尤為重要。本研究通過免疫組織化學方法檢測最常見的HCC組織中Id1蛋白的表達，以分析其與病理分級的關系，進一步明確Id1在肝癌中的作用為HCC的早期診斷提供線索。

1 材料與方法

1.1 材料

煙臺毓璜頂醫(yī)院從2004年5月至2006年12月抽取經(jīng)病理診斷為HCC并進行手術切除的病例44例，其中男36例，女8例；年齡37～75歲，平均年齡49.5歲。HCC部位分別是肝Ⅴ段腫瘤6例，肝Ⅵ段腫瘤4例，肝Ⅵ段+Ⅶ段腫瘤8例，肝Ⅷ段腫瘤2例；肝Ⅱ段+Ⅲ段腫瘤6例，肝Ⅱ段腫瘤7例，肝Ⅳ段腫瘤7例，肝Ⅰ段腫瘤4例。 標本取HCC組織及癌旁組織各一份，另取20例正常肝組織標本做正常對照；所有標本以10%中性福爾馬林液固定，常規(guī)石蠟包埋，組織學分級按照Edmondson-Steiner的分類標準[4]，在HE染色后行病理診斷，將Ⅰ～Ⅱ級作為高分化HCC，將Ⅲ～Ⅳ級作為低分化HCC。其中高分化癌24例(55%)，低分化癌20例(45% )。其中40例有不同程度的肝硬化（91%）。

Id1兔抗人多克隆抗體：購自SANTA CRUZ公司；免疫組織化學二抗應用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化酶(SP)試劑盒和DAB染色試劑盒，購自北京中杉金橋試劑公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學法

厚4μm切片脫蠟后，繼按SP試劑盒介紹的方法進行。Id1一抗?jié)舛炔捎?∶250，設置陰性空白對照和陽性對照，其中以PBS替代一抗作為空白陰性對照，以前列腺癌標本作為陽性對照。

1.2.2 染色結果判定

在高倍鏡下選取癌組織的5個視野，對每個視野用高像素的數(shù)碼相機拍攝，以細胞質染成棕黃色為陽性細胞，然后采用JD801形態(tài)圖像分析軟件（江蘇捷達科技有限公司），計算每張圖片的陽性細胞面積百分比和陽性染色透光度（灰度），然后求出細胞面積百分比和灰度的平均值。以腫瘤細胞陽性百分比及光密度進行腫瘤細胞陽性強度綜合判斷，A：細胞質或核無顯色，B：呈淡黃色云霧狀弱陽性（+ ）；C：黃色顆粒狀，中度陽性（++）；D：深黃色，強陽性（+++）。

1.2.2 統(tǒng)計學分析

應用SPSS12.0軟件分析系統(tǒng)，用直線相關分別分析肝癌分級與Id1光密度、細胞密度之間的關系，采用t檢驗分析組間顯著性差異，以P＜0.05判定為具有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

Id1免疫組織化學染色結果：HCC周圍的正常肝組織和肝硬化組織中Id1均有較強的陽性表達，棕黃色顆粒主要位于肝細胞質內。HCC組織中Id1表達明顯少于周圍組織（圖1）。HCC中分化程度高者呈強或中度表達，HCC中分化程度低者呈現(xiàn)弱或無表達。用圖像分析軟件對陽性染色細胞進行陽性面積百分比和灰度值分析統(tǒng)計顯示，HCC組織中陽性細胞面積百分比和光密度均顯著低于周圍正常肝組織和肝硬化組織（表1）。

圖1 HCC及其周圍肝組織Id1蛋白的染色結果（10×）

表1 id1在肝組織中表達的陽性面積和灰度值比較(±SD)

表1 id1在肝組織中表達的陽性面積和灰度值比較(±SD)

3 討 論

腫瘤的發(fā)生與細胞的增殖分化異常有關，未分化細胞的無限增殖、遠處轉移及局部浸潤的能力是惡性腫瘤重要的特點。細胞分化抑制因子——Id蛋白屬于HLH蛋白中的一類，是一種抑制細胞分化、刺激細胞增殖的相關蛋白，目前在高等生物中發(fā)現(xiàn)4種同源系列Id1、Id2、Id3及Id4，均可與堿性HLH蛋白(bHLH)作用，阻礙bHLH（多為轉錄因子）和DNA的結合，影響特異蛋白的表達，抑制細胞分化。近年國內外研究發(fā)現(xiàn)，在前列腺癌、腸癌、胰腺癌、肝癌、子宮內膜癌、宮頸癌、甲狀腺癌、食管和口腔的鱗狀細胞癌、乳腺癌、鼻咽癌、尤文肉瘤等多種惡性腫瘤中均有Id1蛋白的過度表達[2,5-7]，在鼻咽癌中還可使腫瘤細胞產(chǎn)生耐藥性[8]，而在正常組織中低表達或者無表達，提示在細胞的惡性生長中，Id1蛋白起著重要的作用。2005年，日本研究者首次報道了Id1在肝細胞癌中的表達與細胞分化有關[3]，但多數(shù)結果與之有著不同之處，在HCC中，肝癌細胞分化程度越低，Id1表達越高，認為在Id1蛋白在HCC的早期發(fā)生作用。本研究中使用免疫組織化學方法檢測了HCC及其周圍正常組織和肝硬化組織Id1的表達，發(fā)現(xiàn)Id1蛋白在癌旁組織及正常肝細胞內高表達，在癌組織細胞內表達明顯減少，癌組織分化越低Id1表達量越少，與有關文獻研究一致[3]。

目前有關Id1在HCC中作用機制的報道不多，Id1 在HCC中表達降低的機制尚不清楚。根據(jù)已有的研究推測其可能機制與Id1上游轉化生長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）的作用有關。研究發(fā)現(xiàn)，Id1是TGF-β的靶基因，TGF-β可以通過抑制Smad3-ATP途徑而抑制Id1[9]。有報道，在動物肝臟星形細胞和人HCC細胞中，TGF-β誘導的細胞生長受阻和分化轉移與其抑制Id1有關[10,11]。正常肝臟中缺乏TGF-β，而HCC組織中TGF-β呈強陽性，尤其在低分化組織中表達升高[12]，可以推測這種表達升高可能抑制了Id1的表達，因而Id1在低分化HCC組織中反而降低。在胰腺癌、子宮內膜癌和乳腺癌等惡性腫瘤中，TGF-β的表達與肝癌相反，TGF-β越高，組織惡性度越低，患者預后越好[13-15]。本文結果在一定上可以解釋為何HCC組織中Id1表達與已報道的幾種腫瘤不同，提示不同的組織中及病變的不同時期Id1可能呈現(xiàn)不同的表達特性。Id1的功能及在腫瘤中作用機制目前還未完全闡明，有待進一步的深入研究。

[1] 吳信華,姚登福,蘇小琴,等.肝癌基因譜動態(tài)表達及HSPgp96異常的臨床價值[J]. 世界華人消化雜志,2008,16(1):76-80.

[2] 徐曉慧,于小玲,韓保健,等.細胞分化抑制子Id1在前列腺癌中的表達及意義[J]. 現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學,2006,14(10):1235-1237.

[3] Damdinsuren B,Nagano H,Kondo M,et al.Expression of id proteins in human hepatocellular carcinoma: relevance to tumor dedifferentiation[J]. Int J Oncol,2005,26(2):319-327.

[4] Edmondson HA,Steiner PE. Primary carcinoma of the liver: A study of 100 cases among 48900 necropsies[J]. Cancer,1954,7(3):462-503.

[5] Lin CQ,Singh J,Murata K,et al. A role for id-1 in the aggressive phenotype and steroid hormone response of human breast cancer cells[J]. Cancer Res,2000,60(5): 1332-1340.

[6] Schindl M,Schoppmann SF,Strobel T,et al. Level of id-1 protein expression correlates with poor differentiation,enhanced malignant potential and more aggressive clinical behavior of epithelial ovarian tumors[J]. Clin Cancer Res,2003,9(2): 779-785.

[7] Wilson JW,Deed RW,Inoue T,et al. Expression of id Helix-Loop-Helixproteins in colorectal adenocarcinoma correlates with p53 expression and mitotic index[J]. Cancer Res,2001,61(24):8803-8810.

[8] Cheung HW,Ling MT,Tsao SW,et al. id1-induced Raf/MEK pathway activation is essential for its protective role against taxolinduced apoptosis in nasopharyngeal carcinoma cells[J]. Carcinog enesis,2004,25(6):881-887.

[9] Kang Y,Chen CR,Massague J. A self-enabling TGF beta response coupled to stress signaling: Smad engages stress response factor ATF3 for id1 repression in epithelial cells[J]. Mol Cell,2003,11(4):915-926.

[10] Damdinsuren B,Nagano H,Kondo M,et al.TGF-beta1-induced cell growth arrest and partial differentiation is related to the suppression of id1 in human hepatoma cells[J]. Oncol Rep,2006,15(2):401-408.

[11] Wiercinska E,Wickert L,Denecke B,et al.Id1 is a critical mediator in TGF-beta-induced transdifferentiation of rat hepatic stellate cells[J]. Hepatology,2006,43(5):1032-1041.

[12] idobe Y,Murawaki Y,Kitamura Y,et al.Expression of transforming growth factor-beta 1 in hepatocellular carcinoma in comparison with the non-tumor tissue[J]. Hepatogastroenterology,2003,50(1):54-59.

[13] Pilichowska M,Kimura N,Fujiwara H,et al.Immunohistochemical study of TGF-alpha,TGF-beta1,EGFR and IGF-1 expression in human breast carcinoma[J]. Mod Pathol,1997,10(10): 969-975.

[14] Henriksen R,Gobl A,Wilander E,et al.Expression and prognostic significance of TGF-beta isotypes,latent TGF-beta 1 binding protein,TGF-beta type I and type II receptors,and endoglin in normal ovary and ovarian neoplasms[J]. Lab Invest,1995,73(2):213-222.

[15] Coppola D,Lu L,Fruehauf JP,et al.Analysis of p53,p21WAF1 and TGF-beta1 in human ductal adenocarcinoma of the pancreas:TGF-beta1 protein expression predicts longer survival[J]. Am J Clin Pathol,1998,110(1): 16-23.