α2巨球蛋白與基質金屬蛋白酶-2，9在重癥急性胰腺炎中作用的研究

張穎毅 潘吉勇 宋永蔚 趙 華

1 遼寧省大連市第三人民醫院普通外科（116023）

2 遼寧省大連市中心醫院神經內二科（116023）

重癥胰腺炎約占急性胰腺炎的10%～15%，病情篤重，常合并較多嚴重的并發癥，病死率高達20%～30%[1]，仍是目前較為棘手的急腹癥之一。然而，目前SAP的發病機制尚不十分清楚，對SAP的研究也是多方面、多角度的[2]。在SAP的發生發展中，由于各種炎性因子的刺激，炎癥細胞的過度表達，引起基質金屬蛋白酶-2，9（MMP-2，9）大量釋放[3-6]，進一步刺激炎癥細胞的分化，并引起其抑制劑α2-巨球蛋白在血清中的動態平衡失衡[3]，增加SAP的死亡率。

人α2-M是一種大分子糖蛋白，α2-M的主要功能是結合、清除體內蛋白水解酶，被認為是體內一種重要的防御蛋白[3]。Lohr等研究發現，AP病程中伴有ECM的分解，并與病情的嚴重性相關，因而其可作為預測結果的指標，并間接證明MMP作為主要的基質分解酶在疾病的發生發展中起重要作用[4，6]。如何阻止MMP-2，9的活性表達，減少SAP，隨著MMP-2，9及其抑制劑的深入研究，將成為SAP治療的新靶點。

本實驗目的在于探討α2-M與MMP-2，9在重癥急性胰腺炎（SAP）的相關機制并證實α2-M在SAP中的價值。降低胰腺出血壞死，炎細胞滲出率，從而避免繼發多臟器的損害，為臨床治療提供一個新途徑。

1 材料和方法

1.1 實驗對象

動物：健康普通級成年SD大鼠40只，體重180～200g（由大連醫科大學實驗動物中心提供），雌雄不限。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組和SAP大鼠動物模型的制備

將大鼠按隨機表法編號分組，分為實驗組20只，對照組20只。大鼠術前12h禁食，不禁水，10%戊巴比妥鈉30mg/kg經腹腔注射麻醉后，碘伏消毒，正中切口入腹，由十二指腸前壁阻斷膽胰管進入十二指腸處開口，經胰頭部沿胰腺被膜下插入一號皮試針頭，以0.1mL/min速度勻速注入5%牛磺膽酸鈉（1mL/kg，Sigma公司），10～30 min后見胰腺出現壞死樣改變后逐層關腹。假手術組除胰腺被膜下不注入5%牛磺膽酸鈉外，余同SAP組。動物成模后于24h活殺取材，檢測有關指標。

1.2.1 胰組織學檢查及胰腺損傷評分

（1）標本取材：成模后24 h活殺動物，迅速分離胰腺組織，經%4甲醛固定后制備成石蠟切片（3μm），并將石蠟切片進行蘇木精-伊紅染色（HE），光鏡觀察。（2）HE染色：（3）采用Grewal等的方法對胰腺組織損傷進行定量評估。

1.2.2 胰腺濕重活殺動物后，取胰腺組織立即用分析天平稱濕重。

1.2.3 血清淀粉酶量測定

于成模后24h經大鼠右心室穿刺取血，在室溫靜置30 min后，以2500r/min離心，按試劑盒說明測定血清淀粉酶量。

1.2.4 血清α2-巨球蛋白的測定

于成模后24h經大鼠右心室穿刺取血，在室溫靜置30 min后，以2500r/min離心，采取ELISA法測定血清α2-巨球蛋白。試劑盒購自美國ADL公司，具體方法參見試劑盒按試劑盒說明。

1.2.5 免疫組化法觀測MMP-2，9的表達

以特異性的大鼠MMP-2，9多克隆抗體，作免疫組織化學染色，觀察胰腺組織中MMP-2，9的表達狀況。活殺后取胰腺組織，經甲醛固定后制備成3μm厚的石蠟切片。具體方法參見試劑盒按試劑盒說明。

MMP-2，9的表達程度及范圍通過光鏡下觀察。每批染色均設空白對照（用PBS代替第一抗體）和正常對照（正常胰腺顯色）。結果與正常對照顯色情況進行對比判定。MMP-2，9陽性標準[7，8]：胰腺毛細血管內皮細胞胞漿及細胞外基質細小的棕黃染色顆粒。隨機觀察5個高倍視野，陰性（-）：無著色細胞；弱陽性（+）：1個視野可見稀疏顆粒；中等強度陽性（++）：2～4個視野可見顆粒；強陽性（+++）：每個視野均可見彌漫性顆粒。

1.3 數據處理

數據用χ±s表示，應用SPSS10.0統計軟件進行統計分析。計量資料兩組間比較根據方差齊性與否采用t或t’檢驗；胰腺組織MMP免疫組化的等級資料采用非參數統計的秩和檢驗。P＜0.05為差異有顯著性。

2 結 果

2.1 兩組大鼠胰腺組織損傷評分、胰腺濕重的比較

實驗組胰腺組織損傷評分和胰腺濕重明顯高于對照組（P＜0.05）。見表1。

2.2 兩組大鼠血清淀粉酶和α2-巨球蛋白含量的比較

實驗組血清淀粉酶及α2-巨球蛋白含量明顯高于對照組（P＜0.05）。見表2。

表1 兩組胰腺組織損傷評分、胰腺濕重的比較

表2 兩組血清淀粉酶和α2-巨球蛋白含量的比較

2.3 組織化學染色結果

正常大鼠胰腺形態規則，排列緊湊，無水腫、出血、壞死等（圖1a）。SAP組肉眼可見胰腺壞死出血灶，光鏡見間質腫脹，大量炎細胞浸潤，紅細胞滲出，腺泡細胞和脂肪壞死（圖1b）。

圖1a 對照組胰腺（HE染色10×10）

圖1b SAP組胰腺 （HE染色40×10）

2.4 免疫組化染色結果

SAP組MMP-2，9呈高表達，可見胰腺毛細血管內皮細胞胞漿及細胞外基質細小的棕黃染色顆粒。SAP組MMP-2，9表達陽性率為100%，其中MMP-2強陽性有12例，MMP-9強陽性有9例。而對照組表達陽性率為10%，其中弱陽性2例。2組間比較差異有顯著性 （P＜0.01）。見表3，4。

表3 兩組胰組織MMP-2的表達結果

3 討 論

重癥胰腺炎約占急性胰腺炎的10%～15%，病情篤重，仍是目前較為棘手的急腹癥之一[1，9]。SAP是多因素共同致病的結果，但SAP的發病機制尚不完全清楚[2，9]。近年來，對于α2巨球蛋白（α2macroglobulins，α2-M）、基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）在SAP病理生理過程中的作用已成為急性胰腺炎研究非常活躍的領域，并取得顯著進展[9，11]。本實驗旨在通過檢測SAP大鼠胰腺MMP-2，9的表達及血清中α2-M含量的變化，進一步探討SAP發病機制，為臨床及時采取措施干預SAP病情進展提供理論依據。

表4 兩組胰組織MMP-9的表達結果

本實驗結果顯示，SAP組中MMP-2，9在胰腺組織內呈高表達，表現為毛細血管內皮細胞內及細胞外基質中棕黃色染色顆粒，而在對照組表達甚低（P＜0.01），實驗組胰腺損傷評分、胰濕重較對照組明顯升高，實驗組大鼠血清淀粉酶量及反映病情嚴重程度的指標與MMP-2，9的表達相一致，提示MMP-2，9與SAP病情的發生發展密切相關。

有研究表明，在正常情況下MMP-2，9表達甚微，而在異常情況下，炎癥細胞被激活后，炎性因子大量釋放，促進了MMP-2，9的異常高表達，從而參與病理過程加劇病情的發展[7，11]。我們通過免疫組化染色法觀察SAP大鼠胰腺MMP-2，9的表達情況發現，MMP-2，9在對照組無表達或僅有個別弱陽性表達，而實驗組大鼠則呈強陽性表達；通過組化HE染色還觀察到大量白細胞遷移，浸潤至周圍組織，同時伴有毛細血管擴張、淤血，周圍組織充血、壞死，膿腫形成。由此，我們發現在MMP-2，9呈陽性表達的同時中性粒細胞大量浸潤至細胞間質內，而中性粒細胞本身可以釋放多種炎性因子，進而推測病變組織中中性粒細胞的大量浸潤與MMP-2，9的高表達密切相關。在Keck等的實驗中發現在重癥急性胰腺炎大鼠的肺勻漿和含中性粒細胞的上清液中，MMP-9高表達[8]。用中性粒細胞損耗試驗消耗外周血中的白細胞后，肺組織中性粒細胞浸潤減輕的同時，MMP-9表達亦隨之降低，這表明高表達的MMP-9來源于中性粒細胞。免疫熒光研究也證實了浸潤肺組織的中性粒細胞表達MMP-9[12]，結合我們的實驗觀測進一步證明了這一推斷。

在Muhs及Descamps等的實驗中發現，SAP時肺通透性增加了2倍，肺勻漿MMP-2活性在ANP中3倍于正常對照組，腹水中MMP-2、9的活性增加[6]。Yamaguchi等在油酸誘導的急性胰腺炎大鼠中發現，MMP-2活性較誘導前顯著增強，MMP-2mRNA表達升高12.3倍[10]。Yamaguchi等在蛙皮素和牛黃膽酸鈉誘導的胰腺炎大鼠模型中也發現，Ⅳ型膠原沿基底膜亦呈連續性分布（不同于精氨酸誘導的胰腺炎模型）。而MMP-2在導管上皮的染色強度又與導管周圍基底層的Ⅳ型膠原呈負相關[13，14]。可見MMP-2在急性胰腺炎中的激活和持續高表達，導致胰腺基底膜和間質中的Ⅳ型膠原降解，引起胰腺腺泡和導管上皮結構的破壞。

綜合我們的實驗結果及既往研究，我們認為SAP的病理演變過程可能為前炎癥因子（TNF-α、IL-1β等）發揮著始動作用，刺激中性粒細胞和巨噬細胞表達增加，從而通過細胞黏附因子（ICAM-1、VCAM-1等）粘附于內皮細胞層并通過內皮細胞到達基底基質膜，激活體內信號轉導，各種激酶活化之后使底物磷酸化，增強核因子的DNA結合活性，從而誘導MMP-2，9表達，最終通過MMP-2，9作用胰腺毛細血管，破壞基膜，令胰腺毛細血管通透性增加，使中性粒細胞和巨噬細胞穿透屏障遷移于ECM及腺泡內，繼續釋放MMP-2，9，加重結構破壞，使AP進展至SAP[11，18]。據此提示我們MMP-2及MMP-9可作為SAP病情判定的良好指標[19]。而Yokota等在蛙皮素誘導的急性胰腺炎中，MMP-1和MMP-2均明顯升高；而MMP-9變化不大[7]，這與本次實驗結果不同，我們考慮可能由于不同的誘導劑所引起的胰腺炎模型，其炎癥組織的病理變化不同所致。

作為體內最廣譜的蛋白水解酶抑制劑[20]，α2-M在大多數正常情況下其體內濃度不發生變化。我們的實驗結果顯示α2-M在實驗組大鼠血清含量中升高顯著，這與Bisaro等的研究結果相一致[2]。研究證實，基質金屬蛋白酶家族是細胞外基質降解過程中的重要酶類，而α2-M對基質金屬蛋白酶有抑制作用，它是重要的MMP清除劑，可以非特異性抑制和清除血漿中的MMP[19]。α2-M可用其特殊的“陷阱”機制，把蛋白酶緊緊包裹其中，阻斷其與底物發生反應。α2-M的這種生理功能是否可以阻止MMP發揮作用仍需進一步研究[19]。Bisaro等發現在AP的血清中α2-M和MMP-2，9活性均有所增加，但MMP-2，9的增加總是高于α2-M[20]，結合我們的實驗結果推測可將測定血清中α2-M的活性作為評估SAP病情的一項指標。

綜合本次實驗及既往文獻報道，均提示 MMP-2、MMP-9與α2-M的含量平衡失調是SAP發生發展的重要發病機制之一，我們對MMP-2，9及α2-M關系的深入研究，有望進一步闡明急性胰腺炎的發病機制。我們認為在診治SAP患者過程中測定MMP-2，9的同時測定α2-M含量將更有利于提高SAP的預測與診斷，有助于臨床及早采取治療措施干預并阻斷SAP的病理發展進程、減輕SAP對機體的損害、降低SAP患者的死亡率。

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