苯酚降解菌的固定化及其降解特性的研究

薛 鋒，高 健

(鹽城工學院化學與生物工程學院，江蘇 鹽城 224051)

含酚廢水是一種難降解有機廢水，嚴重污染環境[1]。目前常用微生物處理含酚廢水，但廣泛采用的活性污泥法存在著微生物濃度低、菌體流失的缺點。固定化技術是將分散、游離的微生物通過某種物理或化學的方法集中起來，固定在某一限定區域以提高微生物的活性，有利于提高污染物的處理負荷和去除效率[2，3]。將固定化技術應用到廢水生物處理過程中，可以克服菌體流失的缺點，且固定化細胞降解污染物的效率較游離細胞有很大提高[4～6]。

作者在此以海藻酸鈉為載體，對苯酚降解菌產堿菌(Alcaligenessp.)YC-F81進行包埋，通過單因素實驗確定了較優的包埋條件，并對固定化苯酚降解菌的降解性能進行了初步研究。

1 實驗

1.1 菌株、試劑與培養基

高效苯酚降解菌產堿菌(Alcaligenessp.)YC-F81，自行分離得到。

苯酚，海藻酸鈉，CaCl2。

牛肉膏蛋白胨培養基：牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，苯酚0.3 g，蒸餾水1 L，pH值自然。

苯酚無機培養基：MgSO4·7H2O 0.2 g，KH2PO40.5 g，K2HPO40.5 g，CaCl20.1 g，NaCl 0.2 g，NH4NO30.1 g，蒸餾水1 L，苯酚按需加入。

固體培養基：在牛肉膏蛋白胨培養基中加入20 g瓊脂。

1.2 方法

1.2.1 細菌的培養

將菌株接種到牛肉膏蛋白胨培養基中，在30℃的恒溫培養箱中活化72 h，然后從馴化的菌落中挑取適合的菌落接種到牛肉膏蛋白胨液體培養基中，于30℃、150 r·min-1搖床培養24 h。將菌懸液接種至新鮮的牛肉膏蛋白胨液體培養基，在相同的條件下培養12 h，得到對數生長期的菌體。

1.2.2 海藻酸鈉包埋

將對數生長期的菌懸液低速離心(5000 r·min-1、15 min)后，倒去上清液，稱取適量濕菌體與一定質量濃度的海藻酸鈉溶液充分攪拌混合均勻，用恒流泵自動流入到一定質量濃度的CaCl2溶液中，于4℃冰箱放置12 h，得到直徑均勻的固定化細胞顆粒。用無菌水沖洗后即可使用。

1.3 苯酚含量的測定

采用4-氨基安替吡啉直接光度法[7]。將培養液于5000 r·min-1離心10 min，取上清液100 μL加入到10 mL的試管中，加蒸餾水至5 mL；加入100 μL 0.5 mol·L-1的氨水溶液，用pH值6.8的磷酸緩沖溶液調pH值至7.9左右；加50 μL 2%的4-氨基安替吡啉，混勻；再加50 μL 8%的鐵氰化鉀溶液，混勻，15 min后，測定510 nm處吸光度。

2 結果與討論

2.1 固定化細胞的形態(圖1)

圖1 固定化細胞形態

由圖1可以看出，苯酚降解菌用海藻酸鈉固定化后，為白色不透明小球，直徑5 mm左右，有一定的強度和彈性。

2.2 固定化條件的研究

2.2.1 海藻酸鈉質量濃度對苯酚降解率的影響

海藻酸鈉是一類天然高分子多糖，對微生物沒有毒害作用，但海藻酸鈉的濃度會影響固定化細胞的機械強度、質量傳遞等，進而影響微生物的活性。用不同質量濃度的海藻酸鈉為載體制備固定化細胞顆粒，進行苯酚降解實驗，結果見圖2。

圖2 海藻酸鈉質量濃度對固定化細胞降解苯酚的影響

由圖2可以看出，隨著海藻酸鈉質量濃度的增大，固定化細胞的苯酚降解率有所上升；當海藻酸鈉質量濃度為3.0%時，機械強度和降解率都比較理想；當海藻酸鈉質量濃度超過3.0%時，由于粘度增加，成球比較困難。因此，確定適宜海藻酸鈉質量濃度為3.0%。

2.2.2 凝膠化劑CaCl2質量濃度對苯酚降解率的影響

分別采用不同質量濃度的CaCl2溶液作為凝膠化劑制備固定化細胞顆粒，進行苯酚降解實驗，每個樣平行3次，結果見圖3。

圖 3 CaCl2質量濃度對固定化細胞降解苯酚的影響

由圖3可以看出，當CaCl2質量濃度為4.0%時，降解率達到最大；當CaCl2質量濃度過低或過高時，苯酚降解率都不理想。這是因為，低質量濃度CaCl2在使用過程中會出現膨脹、裂縫或破碎現象；而高質量濃度CaCl2雖然明顯提高了固定化細胞顆粒的機械強度、減少了自由細胞，但固定化細胞顆粒的外層迅速鈣化變硬，而內部鈣化程度仍較低，由于外層的凝膠網格過于緊密，使得固定化細胞顆粒的彈性和擴散性能降低，對底物的利用率也有所下降，其催化性能不理想。因此，確定適宜CaCl2質量濃度為4.0%。

2.2.3 濕菌體量對苯酚降解率的影響

分別以不同量的濕菌體與10 mL質量濃度為3.0%的海藻酸鈉溶液制成海藻酸鈉固定化細胞顆粒，考察濕菌體量對苯酚降解率的影響，結果見圖4。

圖4 濕菌體量對固定化細胞降解苯酚的影響

由圖4可以看出，隨著濕菌體量的增加，降解率不斷升高；但當濕菌體量達到0.4 g后，再增加濕菌體量，降解率升幅不明顯。這是因為，在一定范圍內，單位體積凝膠包埋濕菌體量越多，苯酚降解率越高；但隨著細胞量的增大，固定化細胞與底物的接觸量減小，也有可能是由于細胞中其它成分(蛋白質、多糖等)的增加，產生競爭性吸附，從而影響苯酚降解率。因此，確定適宜濕菌體量為0.4 g。

2.3 降解特性的研究

2.3.1 苯酚濃度對固定化細胞降解苯酚的影響

將0.4 g游離菌體與含等量菌體的固定化小球加入到含苯酚濃度(mg·L-1)分別為300、500、600、800、1000 1200、1500的50 mL無機液體培養基中，于30℃、150 r·min-1搖床培養48 h，每組3個平行，測定其苯酚降解率，結果見圖5。

圖5 苯酚濃度對苯酚降解率的影響

由圖5可以看出，隨著苯酚濃度的增加，游離細胞和固定化細胞對苯酚的降解率都有所下降，但是固定化細胞的苯酚降解率比游離細胞的高，且苯酚的耐受性強于游離細胞。這可能是因為，載體對固定在其中的微生物細胞起到了保護作用，苯酚在由固定化載體表面擴散到載體內部時，生長在載體表層的菌落形成了一層保護屏障。

2.3.2 pH值對固定化細胞降解苯酚的影響

將0.4 g游離菌體與含等量菌體的固定化小球加入到pH值分別為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0的含600 mg·L-1苯酚的50 mL無機液體培養基中，于30℃、150 r·min-1搖床培養48 h，測定其苯酚降解率，結果見圖6。

圖6 pH值對苯酚降解率的影響

由圖6可以看出，固定化細胞與游離細胞降解苯酚的最佳pH值均為6.0～8.0。當pH<6.0或者pH>8.0時，苯酚降解率比較低；在相同pH值下，固定化細胞的苯酚降解率高于游離細胞。這可能是因為，海藻酸鈉對包埋在其中的菌體有一定的保護作用，減輕了環境對菌體的傷害。因此，確定最適pH值為7.0。

2.3.3 溫度對固定化細胞降解苯酚的影響

將0.4 g游離菌體與含等量菌體的固定化小球加入到pH值7.0的含600 mg·L-1苯酚的50 mL無機液體培養基中，分別在不同溫度、150 r·min-1搖床培養48 h，測定其苯酚降解率，結果見圖7。

圖7 溫度對苯酚降解率的影響

由圖7可以看出，30℃時，苯酚降解率達到最大；且在相同溫度下，固定化細胞的降解率比游離細胞高。因此，確定最適溫度為30℃。

2.3.4 NaCl質量濃度對固定化細胞降解苯酚的影響

將0.4 g游離菌體與含等量菌體的固定化小球加入到pH值7.0的含600 mg·L-1苯酚的50 mL無機液體培養基(其中NaCl質量濃度分別為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%)中，于30℃、150 r·min-1搖床培養48 h，測定其苯酚降解率，結果見圖8。

圖 8 NaCl質量濃度對苯酚降解率的影響

由圖8可以看出，固定化細胞對NaCl的耐受性高于游離細胞。NaCl質量濃度超過2.0%后，游離細胞的苯酚降解率很低；而固定化細胞在NaCl質量濃度為2.5%時的苯酚降解率仍有80%左右，其后才明顯下降。這可能是因為，鈉離子是細胞運輸系統的組分，其主要作用是維持滲透壓及某些酶的穩定性，當培養基中鹽含量過高時就有可能破壞細胞的運輸系統或造成某些酶類的失活，影響它們對營養物質的吸收利用和降解，表現為苯酚降解率的下降；細胞固定化后，由于有了載體的保護，固定化細胞周圍的NaCl濃度要遠低于培養基中NaCl的濃度，因而對細胞的運輸系統和酶的傷害較小。因此，NaCl質量濃度應低于2.5%。

3 結論

以海藻酸鈉為載體，將馴化的苯酚降解菌進行了固定化，確定了較佳的固定化條件為：海藻酸鈉質量濃度3.0%、CaCl2質量濃度4.0%、濕菌體量0.4 g/10 mL海藻酸鈉溶液；固定化細胞降解苯酚的最適條件為：溫度30℃、pH值7.0、NaCl質量濃度低于2.5%。在相同條件下，在以苯酚為唯一碳源的無機培養基中投加相同菌量的固定化細胞與游離細胞，固定化細胞的苯酚降解率與耐受苯酚能力明顯高于游離細胞，800 mg·L-1苯酚降解48 h，降解率可達99%以上。

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