響應(yīng)面法優(yōu)化荸薺皮總黃酮的提取工藝

高 山，胡 平，龍世平

(1.湖北民族學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北 恩施 445000；2.恩施職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物工程系，湖北 恩施 445000)

荸薺(Eleocharistuberose)，別名馬蹄、地栗等，是莎草科多年生淺水草本植物[1]，分布廣泛[2]。除直接食用外，還被加工成淀粉、果脯、罐頭和飲料等產(chǎn)品[3]。研究表明，荸薺皮中含有一種不耐熱的抑菌物質(zhì)——荸薺英，荸薺英中含有游離黃酮類化合物、生物堿、有機(jī)酸、皂苷及酚類等成分[4～6]，對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌、綠膿桿菌等均有不同程度的抑制作用，可作為一種天然食品防腐劑用于食品加工[7]。黃酮類化合物具有降血脂、降血糖、增強(qiáng)人體免疫力的功能，并對(duì)糖尿病、高血壓、冠心病等疾病有輔助療效[8]，因此，研究荸薺皮中黃酮類化合物的提取工藝對(duì)提高荸薺的附加值意義重大。

黃酮類化合物常用的提取工藝主要有水提法[9]、微波法[10]、超濾法[11]等，對(duì)于提取工藝的優(yōu)化多采用正交實(shí)驗(yàn)法[12]，而采用響應(yīng)面法優(yōu)化工藝的較少。作者在此采用響應(yīng)面分析法[13]對(duì)荸薺皮總黃酮的提取工藝進(jìn)行了研究，擬為荸薺皮的綜合利用提供一條新的途徑。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料與試劑

荸薺皮：收集于恩施市土橋壩各鮮荸薺市場(chǎng)，剔除雜質(zhì)及腐跡，于干燥箱中80℃烘6 h，再用粉碎機(jī)粉碎，過篩，保存，備用。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，95%乙醇，亞硝酸鈉，硝酸鋁，氫氧化鈉等。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取干燥后的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品20 mg，用30%(體積分?jǐn)?shù)，下同)的乙醇溶解，并全部轉(zhuǎn)入100 mL容量瓶中，用30%乙醇定容，搖勻，得濃度為0.2 mg·mL-1的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別取上述蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0 mL、2.0 mL、4.0 mL、6.0 mL、8.0 mL、10.0 mL、12.0 mL于7支25 mL容量瓶中，加入5%亞硝酸鈉溶液1 mL，混勻，靜置6 min；加入10%硝酸鋁溶液1 mL，混勻，靜置6 min；加入4%氫氧化鈉溶液10.0 mL，混勻，用30%乙醇定容；15 min后于510 nm處測(cè)定吸光度A，以試劑空白作為參比。

1.2.2 提取方法

準(zhǔn)確稱取干燥荸薺皮粉末1 g，加入30%乙醇25 mL，在水浴提取溫度60℃下提取90 min，迅速冷卻，于8000 r·min-1離心8 min，得提取液。

1.2.3 黃酮類化合物含量的測(cè)定

準(zhǔn)確吸取提取液2.5 mL于25 mL容量瓶中，加入5%亞硝酸鈉溶液1 mL，混勻，靜置6 min；加入10%硝酸鋁溶液1 mL，混勻，靜置6 min；加入4%氫氧化鈉溶液10.0 mL，混勻，用30%乙醇定容；15 min后于510 nm處測(cè)定吸光度，將吸光度代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出提取液黃酮類化合物濃度，按下式計(jì)算黃酮類化合物含量：

式中：Q為黃酮類化合物含量，mg·g-1；c為測(cè)定液黃酮類化合物濃度，mg·mL-1；V1為測(cè)量時(shí)定容的體積，mL；V2為提取液體積，mL；V3為測(cè)量時(shí)提取液體積，mL；m為提取時(shí)荸薺皮質(zhì)量，g。

1.2.4 荸薺皮總黃酮提取條件的優(yōu)化

1.2.4.1 單因素實(shí)驗(yàn)

分別改變乙醇體積分?jǐn)?shù)、固液比、提取溫度、提取時(shí)間進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，測(cè)定提取液的吸光度，計(jì)算荸薺皮粉末中總黃酮的提取量(Y)。單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)編碼水平見表1。

表1 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)編碼水平

1.2.4.2 響應(yīng)面法優(yōu)化

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，對(duì)主要因素采用Box-Benhnken設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，并運(yùn)用SAS軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行響應(yīng)面分析，以獲取最佳工藝參數(shù)[14]。

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

測(cè)定蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液在不同濃度時(shí)所對(duì)應(yīng)的吸光度，以濃度為橫縱標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖1。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度c(mg·mL-1)與 吸光度A的回歸方程為A=0.1765c+0.003，相關(guān)系數(shù)R2=0.9993，表明吸光度與蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度呈顯著線性相關(guān)。

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

按照1.2.4.1方法對(duì)荸薺皮粉末進(jìn)行提取，得到各提取條件下的總黃酮提取量見圖2。

圖2 單因素對(duì)總黃酮提取量的影響

由圖2可以看出，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，黃酮類化合物提取量不斷增加，由于50%相比于40%的提取量增加不大，考慮到成本，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)40%為中心點(diǎn)做響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)；固液比為1∶10時(shí)，黃酮類化合物提取量較低，說明受黃酮類化合物溶解度的影響，太小的固液比造成荸薺皮中的黃酮類化合物溶解不完全，而固液比1∶15與1∶30的變化不大，考慮到在提取過程中提取液要揮發(fā)，固液比太小時(shí)操作不便，故選擇固液比1∶20為中心點(diǎn)做響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)；隨著溫度的升高，黃酮類化合物的提取量逐漸增加，當(dāng)溫度升高到70℃時(shí)，黃酮類化合物提取量最高，故選擇提取溫度60℃為中心點(diǎn)做響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)；黃酮類化合物的提取量在提取時(shí)間為90 min時(shí)達(dá)到最高，然后隨提取時(shí)間的延長(zhǎng)趨于穩(wěn)定，綜合考慮，選擇提取時(shí)間為90 min，不采用響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化。

2.3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化工藝參數(shù)

單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、固液比對(duì)荸薺皮中總黃酮的提取量有顯著影響。因此，固定提取時(shí)間為90 min，通過響應(yīng)面分析對(duì)乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、固液比3個(gè)因素進(jìn)行更深入的研究。

2.3.1 Box-Benhnken中心組合設(shè)計(jì)優(yōu)化荸薺皮總黃酮提取工藝

根據(jù)Box-Benhnken 中心組合實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)原理，采用3因素3水平響應(yīng)面分析方案進(jìn)行實(shí)驗(yàn)并采用響應(yīng)面法分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。中心組合實(shí)驗(yàn)的因素與水平設(shè)計(jì)見表2，響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表3，方差分析見表4。

表2 中心組合設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)的因素水平

表3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

圖3 荸薺皮總黃酮提取量影響因素的響應(yīng)面分析

表4 方差分析

由表4可以看出，乙醇體積分?jǐn)?shù)的影響最大，達(dá)到極其顯著水平(P<0.001)，提取溫度、固液比、各平方項(xiàng)、乙醇體積分?jǐn)?shù)與提取溫度的交互項(xiàng)也對(duì)荸薺皮總黃酮提取量影響顯著(P<0.05)。

2.3.2 二次響應(yīng)面回歸模型的建立

響應(yīng)面軟件分析結(jié)果經(jīng)回歸擬合后，得如下回歸方程：

s=0.2991，R-sq=97.7%，R-sq(adj)=93.7%。表明模型的擬合性很好。

響應(yīng)面分析各因素之間的交互作用結(jié)果見圖3。

由圖3可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)荸薺皮總黃酮提取量的影響最為顯著，表現(xiàn)為曲線較陡；而固液比與提取溫度次之，相應(yīng)表現(xiàn)為曲線較為平滑，且隨其數(shù)值的增加或減少，響應(yīng)值變化較小。

對(duì)Xi求偏導(dǎo)并令其為零的三元一次方程組為：

解三元一次方程組得：X1=-0.61、X2=0.32、X3=0.34,即最佳工藝條件為：提取時(shí)間90 min、乙醇體積分?jǐn)?shù)33.9%、提取溫度56.8℃、固液比1∶21.7(g∶mL)。預(yù)測(cè)荸薺皮總黃酮提取量為12.65 mg·mL-1。

2.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取荸薺皮2 g，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為33.9%、提取溫度為56.8℃、固液比為1∶21.7(g∶mL)的最佳條件下進(jìn)行提取，3次實(shí)驗(yàn)得到的總黃酮提取量分別為12.51 mg·mL-1、12.48 mg·mL-1、12.50 mg·mL-1，平均提取量為12.50 mg·mL-1。實(shí)驗(yàn)值與模型預(yù)測(cè)值基本一致，可見該模型能較好地預(yù)測(cè)荸薺皮總黃酮的提取情況。

3 結(jié)論

通過對(duì)預(yù)測(cè)模型的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，荸薺皮總黃酮提取量達(dá)12.50 mg·mL-1，與模型預(yù)測(cè)值基本一致，說明模型能較好地反映實(shí)際情況，利用響應(yīng)面分析法得到的荸薺皮總黃酮的提取工藝參數(shù)真實(shí)可靠，具有實(shí)用價(jià)值。

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