鐮刀菌發酵培養液中纖維素酶的分離純化

鄭金花，郁建平

(貴州大學生化營養研究所，貴州 貴陽 550025)

纖維素酶(Cellulase)是一類能夠將纖維素降解為寡糖和纖維二糖、最終水解為葡萄糖的多組分酶系，廣泛存在于自然界的生物體內，如真菌、細菌、少數動物體內。纖維素酶降解纖維素特異性高、反應條件溫和、環境污染小，已廣泛應用于紡織工業、食品工業、飼料工業、洗滌劑工業、燃料工業及中草藥有效成分的提取等諸多領域[1～4]。

目前，研究較多的產纖維素酶的微生物多是真菌，因為真菌產酶量高，而且產生的是胞外酶，易分離提取。其中研究最多的是木霉屬(Trichoderma)和曲霉屬(Aspergillus)，它們都能產生大量的纖維素酶，尤以木霉屬研究居多，而關于鐮刀菌產纖維素酶的報道尚不多見。自20世紀60年代以來，國內外學者對纖維素酶的分離純化進行了大量研究，但已報道的純化纖維素酶僅110種左右[5，6]，如解玉紅等[7]對菌株K7-2培養液中纖維素酶的分離純化、陳冠軍等[8]對脫墨用棘孢曲霉SM-L22纖維素酶系中內切酶的純化。作者以實驗室篩選的鐮刀菌(Fusarium)菌株液體培養產纖維素酶，在前期實驗的基礎上進行纖維素酶的分離純化，擬為纖維素酶的組分和結構研究奠定基礎。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

稻草秸稈粉末，過60目篩。

CMC-Na，3，5-二硝基水楊酸(DNS)，NaOH，酒石酸鉀鈉，苯酚，無水亞硫酸鈉，檸檬酸，檸檬酸三鈉，NaCl，(NH4)2SO4，PEG6000，考馬斯亮藍R250、G250，乙醇，磷酸，丙烯酰胺，甲叉雙丙烯酰胺，Tris，SDS，過硫酸銨，四甲基己二胺(TEMED)，甘氨酸，甘油，溴酚藍，2-巰基乙醇，甲醇，冰醋酸，所有試劑均為分析純。

透析袋(MD 34)；Sephadex G-100、DEAE-Sephadex A-50，Pharmacia；SDS-PAGE低分子量標準蛋白質，中科院上海生化研究所。

TU-1901型雙光束紫外分光光度計，北京普析通用；DZKW-4型電子恒溫水浴鍋，上海金橋科析儀器廠；JY3002型電子天平；高速萬能粉碎機，天津市泰斯特儀器有限公司；手提式壓力蒸汽消毒器，四川成都醫療器械廠；SP-DJ系列垂直凈化工作臺，上海浦東物理光學儀器廠；SHZ-82型旋轉氣浴恒溫振蕩器，上海梅香儀器有限公司；Beckman J2-21型冷凍離心機；層析柱(11 mm×700 mm，14 mm×200 mm)；DYY-4型穩壓穩流電泳儀、電泳槽，北京市六一儀器廠。

1.2 菌株與培養基

鐮刀菌菌株由貴州大學生命科學學院微生物實驗室篩選提供。

斜面培養基：蔗糖30 g，NaNO32 g，K2HPO41 g，KCl 0.5 g，MgSO40.5 g，FeSO40.01 g，瓊脂18 g，水1000 mL，pH值自然。

種子培養基：蔗糖30 g，NaNO32 g，K2HPO41 g，KCl 0.5 g，MgSO40.5 g，FeSO40.01 g，水1000 mL，pH值自然。

發酵產酶培養基：稻草秸稈粉末0.7715 g，NaNO30.1286 g，K2HPO41 g，KCl 0.5 g，MgSO40.5 g，FeSO40.01 g，AlCl35 mmol·L-1，吐溫-80 0.04%，水250 mL，pH值自然。

1.3 方法

將30℃培養108 h的發酵液于5000 r·min-1離心20 min；取上清液，加硫酸銨至飽和度X，靜置過夜，離心；再取上清液，加硫酸銨至飽和度Y，靜置過夜，離心；取沉淀溶于0.05 mol·L-1pH值4.8的檸檬酸—檸檬酸鈉緩沖溶液中，透析脫鹽并用透析袋濃縮。以上操作在4℃條件下進行。脫鹽粗酶液經Sephadex G-100(柱規格：11 mm×700 mm)層析，采用0.05 mol·L-1、pH值4.8的檸檬酸—檸檬酸鈉緩沖溶液洗脫，每5 mL收集一管，流速為8 min·管-1，分別收集各個蛋白質峰，并檢測各蛋白質峰的OD280和酶活。收集酶活較高的蛋白質峰并濃縮，經DEAE-Sephadex A-50(柱規格：14 mm×200 mm)層析，采用0.5 mol·L-1的NaCl溶液梯度洗脫，每5 mL收集一管，流速為8 min·管-1，分別收集各個蛋白質峰，并檢測各蛋白質峰的OD280和酶活，合并酶活較高的蛋白質峰。

1.4 分析與檢測

1.4.1 酶活的測定[9，10]

于試管中加入2 mL由pH值為4.8的檸檬酸緩沖溶液配制的1% CMC-Na，預熱5 min，再向試管中加入2 mL粗酶液，對照管中加入滅活的粗酶液。于50℃保溫30 min，再沸水浴10 min。向試管和對照管中分別加入3 mL DNS，沸水浴10 min，迅速冷卻至室溫，定容至20 mL，混勻，于540 nm下測吸光度。

酶活定義：在50℃、pH值4.8的條件下，每分鐘由1 mL酶液水解底物產生1 μg葡萄糖的酶量作為1個酶活力單位，以U·mL-1表示。酶活依下式計算：

式中：E為樣品的酶活力，U·mL-1；c為測試液的葡萄糖含量，mg·mL-1；V為定容體積，mL；V1為吸取酶液的體積，mL；t為水解時間，min。

在其它條件一定的情況下，酶活與葡萄糖含量成正比關系，故可直接用葡萄糖含量表示酶活。

1.4.2 蛋白質含量的測定

柱層析時采用OD280粗略測定蛋白質含量，除此之外的蛋白質含量采用考馬斯亮藍G250法測定[11]。

1.4.3 純度鑒定

采用SDS-PAGE垂直板式不連續系統電泳，分離膠濃度為12%，濃縮膠濃度為4%，用0.1%(質量濃度)考馬斯亮藍R250酸性甲醇水染色。

2 結果與討論

2.1 最佳鹽析條件的確定

取100 mL粗酶液，依次加入硫酸銨使其達到不同的飽和度，于4℃下靜置過夜，離心，測上清液中蛋白質含量，結果見圖1。離心所得沉淀用0.05 mol·L-1、pH值4.8的檸檬酸—檸檬酸鈉緩沖溶液復溶至相同體積后，測定其纖維素酶活力及蛋白質含量，結果見圖2。

圖1 不同硫酸銨飽和度下上清液中蛋白質含量

圖2 不同硫酸銨飽和度下沉淀復溶液中蛋白質含量及纖維素酶活力

由圖1和圖2可以看出，硫酸銨飽和度低于30%時，酶活力很低；隨著硫酸銨飽和度的增大，酶活力和蛋白質含量都有所增加；當飽和度大于70%時，蛋白質含量繼續增加但酶活力基本沒變化，說明雜蛋白增多。因此，確定最佳硫酸銨飽和度為30%～70%。即最佳鹽析過程為：取粗酶液200 mL，加硫酸銨至飽和度30%，4℃靜置過夜，離心；再取上清液，加硫酸銨至飽和度70%，4℃靜置過夜，離心；取沉淀溶于0.05 mol·L-1pH值4.8的檸檬酸—檸檬酸鈉緩沖溶液，透析脫鹽并濃縮至7.7 mL。

2.2 Sephadex G-100凝膠柱層析

經鹽析、透析、濃縮后的粗酶液上Sephadex G-100凝膠柱。每管5 mL，收集30管，測定其纖維素酶活力及蛋白質含量，結果見圖3。

圖3 Sephadex G-100層析圖譜

由圖3可知，層析后有3個蛋白主峰和1個酶活力峰，蛋白主峰和酶活力峰并沒有完全重合，說明蛋白質含量很高的峰含有很多的雜蛋白，應依據酶活力峰來確定目標蛋白。經過比較，將5#～8#管合并，脫水濃縮作為下一步純化的對象。

2.3 DEAE-Sephadex A-50離子交換層析

將經過Sephadex G-100柱層析后的酶組分上DEAE-Sephadex A-50離子交換層析柱，以0.5 mol·L-1NaCl溶液梯度洗脫，共收集30管，測定其纖維素酶活力及蛋白質含量，結果見圖4。

圖4 DEAE-Sephadex A-50層析圖譜

由圖4可知，離子交換層析后得到多個蛋白峰，但只有3#、4#、5#管具有顯著的酶活力，將這3管合并，即得到一個內切酶組分。

2.4 纖維素酶的相對分子質量

將離子交換層析所得的3#、4#、5#管合并，濃縮后進行變性不連續垂直平板SDS-PAGE電泳，用BIO-RAD凝膠成像系統記錄電泳結果，見圖5。

M.標準蛋白質 S.纖維素酶樣品

由圖5可知，電泳結果只有一條帶，說明已提純。以各蛋白質遷移率與其對數分子量作圖，得到低分子量標準蛋白質的標準曲線，其線性回歸方程為：y=-0.9800x+5.1434，R2=0.9921。因此得到纖維素酶的相對分子質量為69.746 kDa。

2.5 纖維素酶的純化和分析

利用考馬斯亮藍G250法和1.4.1中酶活測定法分別測定各純化步驟的蛋白質含量和纖維素酶活力，其結果見表1。

表1 鐮刀菌纖維素酶的提純

由表1可以看出，鹽析和透析這兩步的純化倍數僅為1.83倍，是因為在選擇最佳鹽析條件時，為了避免初步分離純化階段酶的較大損失，選擇的范圍較寬造成的；Sephadex G-100凝膠過濾層析的純化倍數有所提高，但仍不是太大，是因為實驗只選取其中酶活較高、雜蛋白較少的組分進行合并分析，其它組分均被棄除，酶的損失很大；經過DEAE-Sephadex A-50離子交換柱層析后，純化倍數提高到了19.56倍，分離純化效果較好，但仍不夠理想，這與酶的特殊性質是分不開的，如易失活等。因此整個實驗應盡可能在4℃條件下進行，并且盡量縮短實驗的準備時間。另外，為了滿足工業生產的需求，篩選高產纖維素酶的菌株和利用分子誘變等相關技術提高其活性，是今后研究的方向。

3 結論

產纖維素酶的鐮刀菌發酵培養液經硫酸銨分級沉淀、Sephadex G-100凝膠過濾層析和DEAE-Sephadex A-50離子交換層析分離純化后，纖維素酶的酶活達到35.25 U·mL-1，比活力由11 265.32 U·mg-1提高到了220 312.50 U·mg-1，提高到了19.56倍，并且電泳只得到一條帶，為進一步研究纖維素酶的組分、結構奠定了基礎。

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