巨大芽孢桿菌Bacillus megaterium NCIB 8508蔗糖磷酸化酶的分離鑒定

李群良，張欣英，姚評佳，魏遠安

(1.廣西大學化學化工學院，廣西 南寧530004； 2.廣西亞熱帶生物資源保護利用重點實驗室，廣西 南寧530004)

三氯蔗糖甜度是蔗糖的600倍，甜味特性十分類似于蔗糖，且甜味純正，沒有任何苦后味；無熱量，不齲齒，穩定性好，且安全性極高，是目前最優秀的功能性甜味劑[1]。蔗糖-6-乙酸酯(S-6-a)是合成三氯蔗糖的關鍵中間體，其合成方法主要有化學法和生物法。相對化學法而言，生物法具有更廣闊的應用前景。1958年，Duff等[2]報道巨大芽孢桿菌BacillusmegateriumNCIB 8508能以葡萄糖為底物發酵生成葡萄糖-6-乙酸酯(G-6-a)。1992年，Joan等也利用該菌以葡萄糖為底物發酵生成G-6-a，并經果糖基轉移酶合成S-6-a；同時嘗試利用該菌以蔗糖為原料直接發酵合成S-6-a，但所生成產物仍是G-6-a。原因可能是受蔗糖水解酶的影響，然而即使該菌蔗糖水解酶發生基因突變或活性受到抑制，最終發酵產物仍是G-6-a，而不是S-6-a[3]。

在微生物中，蔗糖進入細胞有兩條途徑：一條是蔗糖依靠磷酸烯醇式丙酮酸依賴的磷酸轉移酶系統進入細胞內并由蔗糖水解酶水解生成葡萄糖-6-磷酸酯與果糖；另一條是由蔗糖磷酸化酶作用生成葡萄糖-1-磷酸酯與果糖，再由葡萄糖磷酸變位酶形成葡萄糖-6-磷酸酯，進入糖分解途徑[4，5]。根據這兩條糖分解途徑推測，巨大芽孢桿菌BacillusmegateriumNCIB 8508可能還存在蔗糖磷酸化酶，導致該菌即使喪失了蔗糖水解酶活性，也不能以蔗糖為底物直接合成S-6-a。

作者在此通過一系列實驗證明了巨大芽孢桿菌BacillusmegateriumNCIB 8508中確實存在蔗糖磷酸化酶，為以蔗糖為原料直接合成三氯蔗糖關鍵中間體S-6-a奠定了理論基礎。

1 實驗

1.1 試劑

標準蔗糖磷酸化酶S0937 (EC：2.4.1.7)，SIGMA-ALDRICH公司；聚丙烯酰胺凝膠SephacrylTMs-300 high resolution，GE Healthcare公司；丙烯酰胺-雙丙烯酰胺(29∶1，質量濃度40%)，上海生工生物工程；四甲基己二胺(TEMED)，AMRESCO公司；考馬斯亮藍R250、G250，進口分裝，國藥集團；低分子量標準蛋白，北京天根生化公司；其它均為分析純或生化試劑。

1.2 微生物與培養條件

巨大芽孢桿菌BacillusmegateriumNCIM 2087(即巨大芽孢桿菌BacillusmegateriumNCIB 8508)購于印度浦那國家化學實驗室。

種子培養液：葡萄糖2 g，蛋白胨1.5 g，氯化鈉0.5 g，牛肉膏0.05 g，蒸餾水100 mL，pH值7.0～7.5。

發酵培養液：蔗糖50 g，KH2PO40.5 g，K2HPO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KCl 0.2 g，FeSO40.02 g，CoCl2·6H2O 0.012 g，(NH4)2HPO41 g，酵母膏 2 g，CaCO310 g，蒸餾水1 L，pH值中性。

培養條件：培養溫度30℃，搖床轉速180 r·min-1。

1.3 胞內粗酶液的制備

無菌操作下從培養18 h的100 mL種子培養液中取10%于100 mL發酵培養液中，搖床培養6 d。取出發酵培養液，8000 r·min-1冷凍離心30 min，棄上清，固體殘留物中加入0.05 mol·L-1pH值為8.0的Tris-HCl緩沖溶液，低溫超聲破碎(超聲時間與間隔時間均為5 s，全程25 min，功率400 W)，按上述離心條件冷凍離心破碎液，取上清液即為胞內粗酶液。

1.4 3，5-二硝基水楊酸(DNS)顯色液的制備

在500 mL含有182 g酒石酸鉀鈉的熱水溶液中，依次加入6.3 g DNS、262 mL 2 mol·L-1NaOH溶液、5 g苯酚、5 g亞硫酸鈉，攪拌溶解，冷卻至室溫，用蒸餾水定容至1 L，搖勻，貯于棕色瓶中，放置一周左右后使用。

1.5 酶學性質的初步研究

1.5.1 酶活定義

蔗糖磷酸化酶催化蔗糖磷酸化反應是一個可逆反應，其反應式為：

采用DNS法檢測蔗糖磷酸化酶催化活性。酶活定義為：30℃下，每毫升酶液以蔗糖為底物反應生成還原糖的微克數。 由于DNS和還原糖共熱后，被還原成棕色的化合物，顏色的深淺在一定范圍內和還原糖的含量呈線性關系，因此可采用比色法測定吸光值以表征還原糖的含量，進而說明酶的活性。

1.5.2 粗酶液反應速度曲線

取0.1 mL胞內粗酶液與1.9 mL 1%蔗糖水溶液混勻，在30℃、180 r·min-1下搖床反應不同時間(10 s、20 s、30 s、40 s、50 s、1 min、1.5 min、2 min、3 min、5 min、10 min、15 min、20 min、30 min、1 h、1.5 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h)。取出后加入2 mL DNS試劑于沸水浴中顯色5 min，在冷水中冷卻至室溫，測540 nm處吸光值。

1.5.3 pH值對粗酶液酶活的影響

取6份0.1 mL胞內粗酶液分別加入1.9 mL用0.05 mol·L-1磷酸鹽緩沖溶液(pH=6.5、7.0、7.5)與0.05 mol·L-1Tris-HCl緩沖溶液(pH=8.0、8.5、9.0)配制好的1%蔗糖溶液，在30℃、180 r·min-1下搖床反應2 min，采用DNS法在540 nm下測吸光值。

1.5.4 溫度對粗酶液酶活的影響

取0.1 mL胞內粗酶液與1.9 mL 1%蔗糖水溶液，分別在30℃、40℃、50℃、60℃下，180 r·min-1搖床反應0.5 h，采用DNS法在540 nm下測吸光值。

1.6 蔗糖磷酸化酶的純化

1.6.1 硫酸銨鹽析沉淀

取6份5 mL胞內粗酶液，在冰浴中磁力攪拌下緩慢加入硫酸銨粉末，分別使6份胞內粗酶液中硫酸銨飽和度達到30%、40%、50%、60%、70%、80%，4℃放置過夜，8000 r·min-1下冷凍離心30 min，分別測其上清液酶活與蛋白質含量。

1.6.2 SephacrylTMs-300 high resolution凝膠層析

取經鹽析濃縮后的粗酶液1.0 mL加到已用蒸餾水平衡過的SephacrylTMs-300 high resolution凝膠層析柱(10 mm×60 cm，凝膠柱48 cm)上，用蒸餾水洗脫(流速1.0 mL·min-1，吸收波長280 nm，靈敏度0.1 A)，手動收集活性成分。

1.6.3 電泳分析

用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳對活性成分進行分析。采用垂直板狀電泳，分離膠濃度為12%，濃縮膠濃度為4%。

2 結果與討論

2.1 酶學性質的初步研究

2.1.1 粗酶液反應速度曲線

繪制蔗糖磷酸化酶催化反應的速度曲線，見圖1。

圖1 粗酶液的反應速度曲線

由圖1可知，蔗糖磷酸化酶催化蔗糖反應是一個可逆反應[6]，反應液吸光值變化并不很明顯，這主要與蔗糖磷酸化酶的催化特性有關。因為蔗糖磷酸化酶主要是催化蔗糖轉糖基反應，而對酶的水解活性相對較弱[7]。研究發現S.mutans蔗糖磷酸化酶的轉糖基作用還能用于生成羧酸、短鏈脂肪酸、含羥基酸、含二羧基酸等化合物[8]。

2.1.2 pH值對粗酶液酶活的影響(圖2)

圖2 pH值對粗酶液酶活的影響

由圖2可知，pH值為7.5時，粗酶液酶活達到最高。因此，確定該酶的最適pH值為7.5。

2.1.3 溫度對粗酶液酶活的影響(圖3)

圖3 溫度對粗酶液酶活的影響

由圖3可知，溫度為50℃時，粗酶液酶活達到最高。因此，確定該酶的最適溫度為50℃。

2.2 蔗糖磷酸化酶的純化

2.2.1 硫酸銨鹽析沉淀

粗酶液經硫酸銨鹽析沉淀初步純化后，測其上清液酶活與蛋白質含量，并繪制酶活、比活與硫酸銨飽和度的關系圖，結果見圖4。

圖4 硫酸銨鹽析效果圖(0℃)

由圖4可知，硫酸銨飽和度為50%時，鹽析沉淀效果最佳。

2.2.2 SephacrylTMs-300 high resolution凝膠層析

鹽析沉淀純化后的粗酶液用SephacrylTMs-300 high resolution凝膠層析純化，層析洗脫曲線見圖5。

圖5 SephacrylTMs-300 high resolution凝膠層析洗脫曲線

分別從6個收集管取少量與蔗糖溶液反應，并用DNS法檢測，發現5#管能催化蔗糖轉糖基反應。證明巨大芽孢桿菌BacillusmegateriumNCIB 8508胞內粗酶液中確實存在蔗糖磷酸化酶。

2.2.3 SDS-PAGE電泳

對分離過程中各階段的產物進行SDS-PAGE電泳分析，結果見圖6。

1.標準蛋白 2.標準蔗糖磷酸化酶S0937(EC：2.4.1.7) 3.胞內粗酶液 4.50%硫酸銨鹽析沉淀液 5.SephacrylTMs-300 high resolution凝膠層析5#管收集液

由圖6可知，SephacrylTMs-300 high resolution凝膠層析5#管收集液得到的蔗糖磷酸化酶較純，并且與標準蔗糖磷酸化酶S0937(EC：2.4.1.7)電泳帶所處位置相近，分子量大小約為56 kDa。

3 結論

(1)通過硫酸銨鹽析與SephacrylTMs-300 high resolution凝膠層析對巨大芽孢桿菌BacillusmegateriumNCIB 8508胞內粗酶液進行分離純化，經SDS-PAGE電泳檢測發現SephacrylTMs-300 high resolution凝膠層析5#管收集液存在與標準蔗糖磷酸化酶蛋白帶相近的一條蛋白帶，分子量大小約為56 kDa。收集液與蔗糖的反應液經DNS法分析在540 nm處有吸光值，證實具有催化活性，從而證明了巨大芽孢桿菌BacillusmegateriumNCIB 8508粗酶液中確實存在蔗糖磷酸化酶。

(2)酶學性質初步研究表明，巨大芽孢桿菌BacillusmegateriumNCIB 8508蔗糖磷酸化酶的最適pH值為7.5、最適溫度為50℃。反應速度曲線表明，蔗糖磷酸化酶催化蔗糖反應是可逆反應，蔗糖磷酸化酶主要催化作用表現為轉糖基反應。

(3)該研究為利用巨大芽孢桿菌BacillusmegateriumNCIB 8508直接以蔗糖為原料發酵生成蔗糖-6-乙酸酯提供了可能，通過加入蔗糖水解酶與蔗糖磷酸化酶抑制劑或通過分子生物學手段敲除編碼這兩種酶的基因，有可能實現以蔗糖為原料直接合成S-6-a，簡化甜味劑三氯蔗糖的制備步驟，降低生產成本，有利于工業化生產。

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