多環芳烴降解菌的篩選及其對天然水的凈化效果分析

魏 妍，楊嬌艷，王文玲，李 騰，楊 劭

(華中師范大學 湖北省城市水環境生態學重點實驗室，湖北 武漢 430079)

多環芳烴(Polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs)是指一類具備由2個或2個以上苯環以線狀、角狀或成簇形式構成的獨特結構的持久性有機污染物。美國EPA已將16種PAHs列入優先控制污染物黑名單[1]。PAHs污染物主要分布在大氣、土壤、水體沉積物及水體水相中[2]。PAHs會在生物體內積累并通過細胞毒性、遺傳毒性和免疫毒性對生物體產生致癌、致畸、致突變作用，對自然界生物安全和人類健康構成巨大威脅[3]。PAHs在環境中的去除途徑有微生物降解、生物富集、光降解、化學氧化等[4]。其中微生物降解具有環保、高效、廉價的優點，被公認為是去除環境中PAHs的主要途徑之一[5]。20世紀70年代，研究人員開展了利用微生物修復PAHs污染土壤的嘗試[6]，80年代科學家認識到微生物修復是PAHs污染環境修復最具良好前景的技術，并首先用于石油污染環境的修復[7]。

土壤中PAHs的生物修復技術研究較多，但天然水體中PAHs污染物的生物修復技術尚未建立。作者在此選用水環境中存在較廣泛的5種PAHs萘、菲、芴、芘、熒蒽作為研究對象，利用水- 硅油雙相體系篩選本土的PAHs高效降解菌株，并開展高效降解菌初步的水體應用研究，以期為PAHs污染水體的微生物修復奠定一定的理論和應用基礎。

1 實驗

1.1 菌種

采集武漢石化廠活性污泥，靜置，取上清作為菌種來源。

1.2 培養基及PAHs母液的配制

篩選培養基為無機鹽-硅油培養液[8，9]；分離純化培養基為牛肉膏固體培養基。

萘、菲、芴、芘、熒蒽母液均用二甲基亞砜配制，濃度為15 g·L-1，用0.22 μm的有機濾膜過濾，滅菌，備用。

1.3 PAHs降解菌的篩選及分離純化

將采集的活性污泥靜置30 min，取上清5 mL于裝有50 mL滅菌的無機鹽-硅油培養液(含40 mL無機鹽液體培養基和10 mL硅油)的錐形瓶中，于30℃、170 r·min-1振蕩培養3 d，備用。

取0.1 mL PAHs母液于100 mL滅菌錐形瓶中(萘、菲、芴、芘、熒蒽的終濃度為30 mg·L-1)，再加入50 mL新鮮的滅菌無機鹽-硅油培養液。然后移取2 mL上述備用菌液到含PAHs的無機鹽-硅油培養液中，振蕩培養7 d，分別移取2 mL菌液加入到新配制的50 mL滅菌無機鹽-硅油培養液中。重復以上步驟，富集培養8次。取最后一代培養液，按倍數稀釋法將接種液梯度稀釋至10-1～10-7，涂布于牛肉膏固體平板上，置于37℃生化培養箱中培養3 d，待菌落長好后，在平板上選擇不同形態特征的菌落，重新轉接至含30 mg·L-1PAHs的無機鹽-硅油培養液中搖床培養，以驗證其是否具有降解能力，將菌株重新分離純化，最后將純菌種劃線于固體斜面培養基上，于4℃冰箱中保存，備用[10]。

1.4 菌株對萘、菲、芴、芘、熒蒽的降解

參照文獻[10]，取初篩分離到的菌株接種至含萘、菲、芴、芘、熒蒽的無機鹽-硅油培養液中，4 d后接種培養物2 mL至以上述5種PAHs為唯一碳源的50 mL新鮮滅菌的無機鹽-硅油培養液中，PAHs終濃度為30 mg·L-1，于30℃、170 r·min-1振蕩培養。以未接菌的濃度為30 mg·L-1的萘、菲、芴、芘、熒蒽的無機鹽-硅油培養液為對照，設置3個平行，5 d后測定培養液中PAHs的殘留量。

樣品預處理和HPLC的測定條件參照文獻[11，12]。

1.5 菌種鑒定

將篩選得到的菌株劃線于牛肉膏固體平板上，置于37℃生化恒溫培養箱中培養72 h，觀察菌落的形態，并取樣進行革蘭氏染色，鏡檢觀察菌體的形態和大小[13]。

對篩選得到的菌株的16S rDNA部分序列進行PCR擴增、序列分析及系統發育樹構建[14]。

1.6 游離菌對湖水中PAHs的生物修復研究

取300 mL滅菌湖水至三角瓶中，添加PAHs母液0.05 mL，使得PAHs的終濃度為2.5 mg·L-1。將分離純化得到的菌株經牛肉膏蛋白胨培養基富集培養后，取對數生長期的菌液，按接種量3%轉接到裝有滅菌湖水的三角瓶中。細菌密度設為3.15×106個·mL-1和4.76×107個·mL-1。于30℃、170 r·min-1搖床避光培養。每組均設2個平行，以未接菌組作對照。每隔24 h取水樣5 mL，于-20℃保存。5 d后測定各樣品中PAHs的殘留量。CODMn、TN、TP等水質指標測定參照《水和廢水監測分析方法》(第四版)[15]。

1.7 統計分析方法

所有數據利用 GraphPad Prism4 軟件進行統計分析。

2 結果與討論

在用水-硅油雙相體系篩選降解菌的過程中，硅油相由無色變淺紅，進一步變橙紅，水相由無色逐漸變成橙黃色。據報道[16]，Grifoll等研究發現芴在生物降解過程中會產生某些橙黃色物質，使培養液的顏色發生變化，同時水相由澄清變渾濁，表明存在以PAHs為碳源的降解菌株。經分離純化獲得一株PAHs高效降解菌，命名為W3。

2.1 菌株W3對萘、菲、芴、芘、熒蒽的降解效果

菌株W3對萘、菲、芴、芘、熒蒽的降解效果如圖1所示。

圖1 W3在水-硅油雙相體系中對萘、菲、芴、芘、熒蒽的降解率

由圖1可看出，在水-硅油雙相體系中，在接種量為4%(體積分數)、細菌密度約為2×108個·mL-1的條件下避光振蕩培養5 d后，W3對萘的降解率最高，達到(94.00±2.83)%；芘次之，為(91.65±1.63)%；菲、芴、熒蒽的降解率分別達到(81.15±1.63)%、(87.65±4.71)%和(87.20±2.12)%。

2.2 菌株的形態觀察及分子鑒定分析

將W3培養3 d后，觀察菌落的形態。在牛肉膏固體平板上其菌落呈規則圓形，淺黃色，中間有白色突起，表面光滑，邊緣整齊。革蘭氏染色為陰性，在100倍的油鏡下觀察為短桿狀，大小約為2 μm。

在GenBank中經BLAST分析表明，W3菌株序列與綠膿假單胞菌的16S rDNA序列相似程度達98%。選擇12個菌種的16S rDNA序列與W3的16S rDNA全序列進行系統發育分析，發現 W3與香芳醇假單胞菌Pseudomonascitronellolis(序列登錄號AF530071.1)聚類，支持率100%。

2.3 菌株對湖水中PAHs的生物修復效果

測得湖水中TN、TP、CODMn分別為1.93 mg·L-1、0.54 mg·L-1、5.68 mg·L-1，pH值為7.7。將分離到的菌株W3進行水體應用研究實驗，在30℃、170 r·min-1振蕩培養條件下的降解效果見圖2。

圖2 W3在水體中對萘(a)、菲(b)、芴(c)、芘(d)、熒蒽(e)的降解效果

由圖2可看出，當細菌密度為3.15×106個·mL-1時，5 d后W3對水體中萘、菲、芴、芘、熒蒽的降解率分別達到(34.07±7.07)%、(24.78±0.51)%、(56.95±5.06)%、(19.67±3.18)%、(35.10±5.22)%；當細菌密度為4.76×107個·mL-1時，5 d后W3對萘、菲、芴、芘、熒蒽的降解率分別達到(59.27±8.54)%、(44.35±10.79)%、(66.64±2.35)%、(26.40±6.36)%、(53.86±4.07)%。可見在水體中W3對各PAHs的降解程度并不一致，對芴的降解率最高，芘最低。經過統計分析，細菌密度數量級超過106和107時，W3對以上5種PAHs的降解率并無顯著性差異(P>0.05)，說明在此區間的細菌密度對PAHs的降解并不構成顯著影響。

培養過程中未加菌的對照組中PAHs濃度也有不同程度的減少，由于本實驗所用的是滅菌湖水，消除了雜菌對W3的競爭和影響；而避光條件又消除了光解的因素，因此對照組PAHs濃度減少的主要原因可能是揮發。投菌實驗組降解率顯著高于對照組，但降解率提高幅度僅為4.45%～49.71%，而在相同培養條件下，無機鹽-硅油培養液中的降解率均超過了80%，表明水體應用研究中降解效果遠不夠理想。這是因為，在水中微生物生長營養不充分，而培養基中水-硅油雙相體系為降解菌生長提供了充足的營養，微生物在兩相界面或水相中利用PAHs作為唯一碳源，既能為微生物生長提供足夠的營養，又不抑制微生物的活性，從而增強了微生物的代謝功能，提高了降解效率。

2.4 討論

迄今，分離篩選到多種降解PAHs的細菌，包括假單胞菌(Pseudomonas)、紅球菌(Rhodococcus)、微球菌(Micrococcus)、帕氏氫噬胞菌(Hydrogenophagapalleron)、芽孢桿菌(Bacillus)、假中間蒼白桿菌(O.pseudintermedium)、微桿菌(Microbacterium)、叢毛單胞菌(Comamonas)、黃桿菌(Flavobacerium)、氣單胞菌(Aeromonas)、產堿菌(Alcaligenes)、棒狀桿菌(Corynebacteria)、雷伯氏菌(Klebsiella)、分枝桿菌(Mycobacterium)、鞘氨醇單胞菌(Sphingomonas)、茄鐮孢菌(Fusariumsolani)、諾卡氏菌 (Nocardia)、糖絲菌(Saacharothrix)、白腐真菌(Phanerochaetechrysosporium)、拜葉林克氏菌(Beijerinckia)等[10～12，16，17]，其中以假單胞菌居多，表明假單胞菌是一類能廣泛而有效地降解PAHs的細菌。

本研究采用水-硅油雙相體系從武漢石化廠活性污泥中篩選到的降解菌W3，經16S rDNA序列分析屬于假單胞菌屬。不同環境中假單胞菌對PAHs的降解特性和效果等已有較多研究報道。賈燕等[11]分析了假單胞菌N7對水中萘的降解特性，在30℃、pH值7.5的條件下，N7在3 d內對100 mg·L-1萘的降解率達到95.66%。楊金水等[18]從南洋油田中分離到兩株假單胞菌S17和S28，在無機鹽培養基中，對1 g·L-1菲的降解率分別達到了88.86%和82.02%。Gordon等[12]篩選到產堿假單胞菌PA-10，在168 h內對熒蒽的降解率可達95%。本研究篩選的W3在5 d內對萘、菲、芴、芘、熒蒽的降解率都超過了80%，相對于以上報道的假單胞菌，W3對PAHs降解范圍更加廣泛。在實際的污染環境中，PAHs通常都以混合形式存在，因此W3更適用于PAHs污染環境的治理。本研究采用的水-硅油雙相體系篩選法相對于傳統的篩選法具有一定的優勢，大多數微生物對有機物的降解要在水相中進行，而PAHs又難溶于水，水-硅油雙相體系就給微生物提供了一個特殊的環境，可避免PAHs對微生物的抑制作用[4]。硅油對PAHs的分配作用和菌體吸附在有機溶劑和水界面的特性對生物降解PAHs起到了至關重要的作用。

實際應用方面，利用微生物修復PAHs污染已有較多報道，主要集中在對污染土壤和水體的修復方面。

在污染土壤方面，May等[19]在生物反應器中用白腐真菌(Phanerochaetechrysosporium)處理受PAHs污染的土壤，36 d后相對分子質量低的PAHs的降解率為70%～100%，相對分子質量高的PAHs的降解率為6%～50%。該系統對PAHs的降解范圍廣泛，降解效果均較好，但周期較長、成本較高。Juhasz等[20]用從煤制氣廠區土壤篩選出來的混合菌群修復PAHs污染的土壤，該菌群可降解3、4、5、7環的PAHs。研究結果表明，實驗中所有PAHs的含量均明顯下降，91 d后苯并[a]芘的含量約降低25%。該菌群對多種PAHs具有很廣泛的降解范圍，但是效率不高，周期較長。

在污染水體方面，Manohar等[21]將假單胞菌屬NGK1菌系用于萘的降解，結果表明，在萘濃度為50 mmol·L-1的廢水中，游離細胞4 d后對萘的降解率最高達到80%；固定于聚氨酯泡沫中的細胞6 d后 可將萘全部降解。本研究篩選的假單胞菌W3，在投菌量為3%、細菌密度為4.76×107個·mL-1時，5 d后對天然水中萘、菲、芴、芘、熒蒽的降解率分別達到了(59.27±8.54)%、(44.35±10.79)%、(66.64±2.35)%、(26.40±6.36)%、(53.86±4.07)%。相比NGK1菌系，W3降解效率不夠高，主要原因是天然水中細菌生長的營養條件較低，限制了其降解能力的發揮，但W3對多種PAHs均有降解效果，降解范圍比較廣泛，且分離自我國石化廠活性污泥，為本土菌種，生物安全性高，有一定使用價值。

文獻中有關PAHs微生物降解研究多以培養基或土壤為介質，針對天然水體條件下PAHs污染的微生物修復研究較少，而PAHs是我國天然水體的常見污染物，也被列入我國優先控制污染物黑名單。本研究結果對于建立適用于天然水體PAHs微生物修復方法具有一定參考價值。由于投菌法雖然操作簡便，但在污染水體修復中易于流失，因此需要對微生物的固定化技術等進行進一步的研究。

3 結論

(1)從武漢石化廠活性污泥中篩選到一株PAHs高效降解菌株W3，經16S rDNA序列分析初步鑒定屬于假單胞菌屬。在PAHs濃度為30 mg·L-1的無機鹽-硅油培養液中培養5 d后，該菌株對萘、菲、芴、芘、熒蒽的降解率分別達到了(94.00±2.83)%、(81.15±1.63)%、(87.65±4.71)%、(91.65±1.63)%和(87.20±2.12)%。

(2)在實驗室內以南湖湖水模擬PAHs污染水體對W3進行了初步的水體應用研究，在投菌量為3%、30℃、170 r·min-1的振蕩培養條件下，W3對5種PAHs有不同程度的降解能力，具有一定的生物修復前景；當細菌密度為3.15×106個·mL-1時，5 d后W3對萘、菲、芴、芘、熒蒽的降解率分別達到(34.07±7.07)%、(24.78±0.51)%、(56.95±5.06)%、(19.67±3.18)%、(35.10±5.22)%；當細菌密度為4.76×107個·mL-1時，5 d后W3對萘、菲、芴、芘、熒蒽的降解率分別達到(59.27±8.54)%、(44.35±10.79)%、(66.64±2.35)%、(26.40±6.36)%和(53.86±4.07)%。

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