短小芽孢桿菌β-1，4-葡聚糖內(nèi)切酶基因的克隆及在大腸桿菌中的分泌表達(dá)

郭成栓，歐陽(yáng)蒲月，崔堂兵，郭 勇

(1.廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院中藥和生物系，廣東 廣州 510520；2.華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510640)

堿性纖維素酶是一種可以在堿性條件下發(fā)揮催化作用的β-1，4-葡聚糖內(nèi)切酶，是一種非全組分的內(nèi)切葡聚糖酶，已廣泛應(yīng)用于洗滌劑、印染、脫墨等行業(yè)[1～4]，應(yīng)用前景廣闊。從自然界中篩選高活力的β-1，4-葡聚糖內(nèi)切酶產(chǎn)生菌，克隆其基因并利用強(qiáng)啟動(dòng)子進(jìn)行表達(dá)是提高酶產(chǎn)量的重要措施。到目前為止，雖然已有一些β-1，4-葡聚糖內(nèi)切酶基因被克隆并得到了表達(dá)，但表達(dá)活力大部分較低。作者應(yīng)用PCR方法從一株短小芽孢桿菌H12中克隆了編碼β-1，4-葡聚糖內(nèi)切酶的基因，并將該基因構(gòu)建在大腸桿菌表達(dá)載體pET20b中，在重組大腸桿菌中得到了良好的分泌表達(dá)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑與培養(yǎng)基

H12菌株，分離自土壤；大腸桿菌表達(dá)載體pET20b，Novagen公司；限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、TaqDNA聚合酶、pMD18-T載體及蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)，TaKaRa公司；羧甲基纖維素(CMC)，Sigma公司；DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，TIANGEN公司；膠回收試劑盒，QIAGEN公司；引物由Sangon公司合成；其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

LB培養(yǎng)基[5]：1%蛋白胨，1%NaCl，0.5%酵母膏，pH值7.0，121℃滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 短小芽孢桿菌DNA的提取

DNA的提取采用十二烷基磺酸鈉-蛋白酶K-酚氯仿法[6]。

1.2.2β-1，4-葡聚糖內(nèi)切酶基因的克隆及序列分析

以抽提的H12細(xì)菌DNA作為PCR擴(kuò)增的模板，上游引物為5′-GCTGTTTACTATGC-3′，下游引物為5′-TTATTTATTCGGAAG-3′。PCR反應(yīng)體系(50 μL)為：10×Taq緩沖溶液 5 μL，模板DNA 1 μL，10 μmol·L-1引物各1 μL，10 μmol·L-1dNTP 1 μL，5 U·μL-1TaqDNA聚合酶0.5 μL，超純水35.5 μL，混勻。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性1 min，50℃退火1 min，72℃延伸2 min；進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。將PCR擴(kuò)增得到的2 kb條帶膠回收，然后與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，篩選陽(yáng)性克隆進(jìn)行序列測(cè)定。將重組T載體送上海生工生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序，堿基序列的比對(duì)由美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(NCBI)網(wǎng)站的BLAST軟件進(jìn)行，得到數(shù)據(jù)庫(kù)中與該菌株同源性最高的基因序列。

1.2.3 酶分子三維模型的構(gòu)建

β-1，4-葡聚糖內(nèi)切酶三維模型的構(gòu)建由日內(nèi)瓦生物醫(yī)學(xué)研究所建立發(fā)展起來(lái)的分子模建服務(wù)系統(tǒng)SWISS-Model L[7]進(jìn)行。采用一系列工作軟件，從蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)中提取蛋白質(zhì)查詢序列的模擬結(jié)構(gòu)信息，利用具有蛋白質(zhì)相似性的已知結(jié)構(gòu)蛋白建立未知結(jié)構(gòu)蛋白的分子模型，酶結(jié)構(gòu)顯示和分析由軟件Deepview (SWISS-Pdbviewer Version 3.7) 進(jìn)行。

1.2.4 DNA的酶切、回收、連接及質(zhì)粒的抽提

DNA的酶切及連接參照TaKaRa公司的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，DNA回收按QIAGEN公司試劑盒進(jìn)行，質(zhì)粒的抽提參照文獻(xiàn)[6]進(jìn)行。

1.2.5 大腸桿菌表達(dá)載體的構(gòu)建

以重組pMD18-T-EglA載體作為模板，重新設(shè)計(jì)一對(duì)引物5′-ATCTGGATCCATGCACATTTTTG-3′、5′-ATCGCTCGAGTTATTTATTCGGAAG-3′，分別引入BamHI和XhoⅠ酶切位點(diǎn)。進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件同1.2.2，將擴(kuò)增得到的2 kb條帶用內(nèi)切酶BamHI和XhoⅠ雙酶切，載體pET20b同樣用BamHI和XhoⅠ雙酶切，回收大的片段，然后用T4DNA連接酶連接兩個(gè)大的片段，轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株BL21(DE3)，利用LB氨芐青霉素平板篩選重組轉(zhuǎn)化子，提取重組質(zhì)粒并用內(nèi)切酶酶切鑒定。

1.2.6 大腸桿菌的轉(zhuǎn)化

大腸桿菌感受態(tài)的制備及轉(zhuǎn)化參照文獻(xiàn)[6]進(jìn)行。

1.2.7 異丙基-β-D-硫代半乳糖苷誘導(dǎo)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子分泌表達(dá)

挑取平板上的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，將其轉(zhuǎn)到添加0.2%羧甲基纖維素(CMC)的LB培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)一定的時(shí)間，用0.2%的剛果紅染色20 min，然后用1 mol·L-1NaCl溶液洗滌20 min，觀察水解圈的大小。

1.2.8 十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)

將重組質(zhì)粒pET20b-EglA轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)中，獲得含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌BL21(DE3)/pET20b-EglA重組菌株。將重組菌株轉(zhuǎn)接到含10 μg·mL-1氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中于37℃培養(yǎng)過(guò)夜。以2%的接種量轉(zhuǎn)到含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，加入IPTG至終濃度1 mmol·L-1，誘導(dǎo)培養(yǎng)一定時(shí)間。取上述培養(yǎng)菌液1 mL于室溫下12 000 r·min-1離心1 min，收集菌體，加入100 μL 2 BV的SDS上樣緩沖溶液，于沸水中處理5 min，離心取上清收集菌體，破壁進(jìn)行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳。

2 結(jié)果與討論

2.1 酶基因的克隆及序列分析

應(yīng)用PCR方法克隆了編碼β-1，4-葡聚糖內(nèi)切酶的讀碼框基因序列，電泳顯示該條帶大小為2 kb，與目標(biāo)條帶大小相同，將該條帶克隆到T載體pMD18-T中，送上海生工生物工程技術(shù)有限公司測(cè)序。結(jié)果表明，該基因讀碼框堿基長(zhǎng)度為1980 bp，編碼659個(gè)氨基酸，該基因序列已被收錄于GenBank，登錄號(hào)為EF620915，經(jīng)GenBank等國(guó)際核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，其與枯草芽孢桿菌KSM-522[8]及短小芽孢桿菌S-27[9]的β-1，4-葡聚糖內(nèi)切酶編碼基因具有較高的同源性，達(dá)到98%，其中與短小芽孢桿菌S-27的編碼基因有20個(gè)堿基的差別，由于密碼子簡(jiǎn)并性的存在，反映到β-1，4-葡聚糖內(nèi)切酶氨基酸順序上，則有6個(gè)氨基酸的差別。

圖1 β-1，4-葡聚糖內(nèi)切酶三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

β-1，4-葡聚糖內(nèi)切酶的結(jié)構(gòu)域分析(圖1)顯示：β-1，4-葡聚糖內(nèi)切酶是由兩個(gè)不連續(xù)結(jié)構(gòu)域組成的標(biāo)準(zhǔn)蛋白，其一為N-端催化結(jié)構(gòu)域，由糖基水解酶家族9組成，該結(jié)構(gòu)域主要起催化底物水解的作用，其中405～421氨基酸、455～473氨基酸分別為酶的兩個(gè)催化活性中心；其二為C-端底物結(jié)合結(jié)構(gòu)域，由碳水化合物綁定結(jié)構(gòu)域家族3組成，從501號(hào)氨基酸殘基開(kāi)始到658號(hào)氨基酸殘基共158個(gè)氨基酸殘基，可以與纖維素表面結(jié)合[10]，從而使催化易于進(jìn)行；兩個(gè)催化結(jié)構(gòu)域之間由一段連接肽連接。β-1，4-葡聚糖內(nèi)切酶的N-端和C-端結(jié)構(gòu)不同，其中N-端催化結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋結(jié)構(gòu)組成，而C-端結(jié)合結(jié)構(gòu)主要由β-折疊結(jié)構(gòu)組成。該類結(jié)構(gòu)的纖維素酶報(bào)道較少，僅在芽孢桿菌KSM-522及短小芽孢桿菌中有報(bào)道[10，11]。β-1，4-葡聚糖內(nèi)切酶的最適pH值為堿性且具有較廣泛的作用pH值，是一種具有較好應(yīng)用前景的洗滌劑用酶。

2.2 表達(dá)載體的構(gòu)建

兩種引物分別引入了BamHI和XhoⅠ酶切位點(diǎn)。以重組pMD18-T-EglA為模板，PCR 擴(kuò)增獲得β-1，4-葡聚糖內(nèi)切酶基因片段，長(zhǎng)1980 bp，將該基因克隆到pET20b中，獲得重組表達(dá)載體pET20b-EglA。利用雙酶切進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果證明質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.3 陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子在LB-CMC平板上的分泌表達(dá)(圖2)

圖2 β-1，4-葡聚糖內(nèi)切酶在LB-CMC平板上的分泌表達(dá)

從圖2可以看出，菌落周圍具有直徑較大的清晰的透明圈，這初步說(shuō)明β-1，4-葡聚糖內(nèi)切酶基因在大腸桿菌中得到了高效分泌表達(dá)。

2.4 重組葡聚糖內(nèi)切酶的誘導(dǎo)表達(dá)及分析鑒定

對(duì)重組菌株發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE分析，并和空白菌株及未加誘導(dǎo)物的重組菌株進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果見(jiàn)圖3。

M.標(biāo)準(zhǔn)蛋白 1.添加誘導(dǎo)劑IPTG的大腸桿菌BL21(DE3)發(fā)酵液 2.未添加誘導(dǎo)劑IPTG的重組大腸桿菌BL21(DE3)/pET20b-EglA發(fā)酵液 3.添加誘導(dǎo)劑IPTG的重組大腸桿菌BL21(DE3)/ pET20b-EglA發(fā)酵液

從圖3可以看出，在培養(yǎng)基中加入1 mmol·L-1的IPTG作為誘導(dǎo)物的重組菌株在73 kDa左右處有一表達(dá)蛋白條帶，而未誘導(dǎo)菌株及空白菌株都沒(méi)有條帶，表達(dá)蛋白的分子大小與理論值大小基本一致。

3 結(jié)論

應(yīng)用PCR方法克隆了短小芽孢桿菌β-1，4-葡聚糖內(nèi)切酶基因?；蛐蛄蟹治霰砻?，該基因大小為1980 bp，編碼659個(gè)氨基酸。三維結(jié)構(gòu)研究表明，β-1，4-葡聚糖內(nèi)切酶有兩個(gè)功能區(qū)域，一是N-端催化結(jié)構(gòu)域，由糖基水解酶家族9序列組成，起催化作用；二是C-端結(jié)合結(jié)構(gòu)域，由碳水化合物綁定結(jié)構(gòu)域家族3組成，可以與纖維素表面結(jié)合，兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間由一段連接肽連接。將β-1，4-葡聚糖內(nèi)切酶基因構(gòu)建在大腸桿菌表達(dá)載體pET20b中，得到重組表達(dá)載體pET20b-EglA，將重組載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)，獲得BL21(DE3)/pET20b-EglA重組菌株。在誘導(dǎo)物IPTG的誘導(dǎo)下，β-1，4-葡聚糖內(nèi)切酶基因在重組大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)了高效分泌表達(dá)，為該酶的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用及后續(xù)定向進(jìn)化等研究奠定了良好基礎(chǔ)。

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