黃皮洋蔥寡糖提取工藝的研究

田 園，史美麗，劉錦梅

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)化學(xué)與藥學(xué)院，山東 青島 266109)

寡糖是由2～10個(gè)單糖通過(guò)糖苷鍵連接形成的直鏈或支鏈的低度聚合糖，有功能性寡糖和普通寡糖之分。功能性寡糖具有獨(dú)特的生理活性，能顯著改善脂質(zhì)、降低血清膽固醇、提高人體免疫力、分解致癌物、促進(jìn)腸道蠕動(dòng)、防止便秘[1]。天然植物中含有未曾發(fā)現(xiàn)和認(rèn)知的新型寡糖，因此篩選含有寡糖的天然植物以及進(jìn)行天然寡糖的提取分離等研究對(duì)生命科學(xué)的發(fā)展具有一定的學(xué)術(shù)意義。

洋蔥(AlliumcepaL.)，別名玉蔥，為百合科(Liliaceae)蔥屬(Allium)植物[2]，其活性成分洋蔥寡糖可提高機(jī)體免疫力，激活巨噬細(xì)胞的吞噬活性，對(duì)預(yù)防、抑制和殺死腫瘤細(xì)胞有重要作用[3]。在飼料中添加適量洋蔥寡糖，可顯著提高肉雞的日增重、降低肉雞大腸糞便中NH3-N含量[4]。作者以黃皮洋蔥為原料提取洋蔥寡糖，優(yōu)化了洋蔥寡糖提取及分離純化工藝，以期為洋蔥寡糖結(jié)構(gòu)表征和生理活性研究奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 原料、試劑與儀器

黃皮洋蔥，市售。

正丁醇、氯仿、無(wú)水乙醇，分析純，萊陽(yáng)市康德化工有限公司；蒽酮，分析純，上海市五聯(lián)化工廠；活性炭，珠海市懷玉山活性炭科技有限公司；Sephadex G-25，上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司；葡萄糖，分析純，天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠； 考馬斯亮藍(lán)G250，分析純，上海如吉生物技術(shù)有限公司。

DF-Ⅱ型集熱式恒溫磁力攪拌器，江蘇省金壇市恒豐儀器廠；752型紫外分光光度計(jì)、AR2140型電子天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司；DBS-100型電腦全自動(dòng)部分收集器，上海滬西分析儀器廠有限公司；B-260型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；S21-4型恒溫水浴鍋，上海悅豐儀器儀表有限公司；真空冷凍干燥機(jī)，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；干燥烘箱，上海福瑪實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 原料含水量及寡糖含量的測(cè)定

分別稱取新鮮洋蔥33.1200 g、23.5600 g、15.6100 g，置于50℃烘箱中干燥至恒重，計(jì)算平均含水量(以總質(zhì)量計(jì)，下同)。

精確稱取洋蔥50.0000 g，組織破碎勻漿，用4 BV的95%乙醇洗滌(除去可溶性單糖)，抽濾，濾渣重復(fù)洗滌2次，加水，在料液比為1∶4(g∶mL，下同)、提取溫度為70℃、提取時(shí)間為90 min的條件下提取得到洋蔥寡糖液，重復(fù)提取3次，合并提取液，旋蒸濃縮，濃縮液加水溶解定容至250 mL，取1 mL溶液，采用蒽酮-硫酸比色法測(cè)定寡糖含量。平行測(cè)定3次。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制[5]

精確稱取干燥至恒重的葡萄糖50.00 mg置于50 mL容量瓶中，加純凈水溶解，定容至刻度，搖勻，即得1.0 g·L-1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。

精確移取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL、8 mL、10 mL，分別置于50 mL容量瓶中，加水至刻度。分別取上述溶液1.0 mL置10 mL具塞試管中，加入0.2%蒽酮試劑4.0 mL，迅速浸于冰水浴中冷卻，然后放入熱水浴中，具塞，煮沸10 min，自來(lái)水冷卻。室溫放置10 min，以試劑空白為參比，用紫外分光光度計(jì)在620 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以糖濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.2.3 洋蔥寡糖提取單因素實(shí)驗(yàn)

精確稱取50 g洋蔥，組織破碎勻漿，以提取溶劑、提取次數(shù)、料液比、提取時(shí)間、提取溫度為單因素變量提取洋蔥寡糖，提取液旋蒸濃縮，濃縮液醇沉，離心、干燥，得粗寡糖；粗寡糖水溶，定容至250 mL；取1 mL，采用蒽酮-硫酸比色法測(cè)定寡糖含量，考察各單因素對(duì)寡糖提取率的影響。

1.2.4 洋蔥寡糖提取正交實(shí)驗(yàn)

以水為提取溶劑，以寡糖提取率為考察指標(biāo)，選擇料液比 、提取時(shí)間、提取溫度為考察因素，采用L9(34)正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化提取工藝。正交實(shí)驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表1。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素及水平

1.2.5 洋蔥寡糖的分離純化

采用活性炭脫色法處理寡糖提取液。以紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在570 nm處測(cè)定寡糖提取液脫色前后吸光度，按下式計(jì)算脫色率。

同時(shí)用蒽酮-硫酸比色法測(cè)定脫色前后寡糖的含量，計(jì)算寡糖回收率。確定最佳脫色工藝。

式中：M前、M后分別為脫色前后的寡糖含量。

脫色后的溶液采用Sevag法脫蛋白。加入體積分?jǐn)?shù)為20%的Sevag試劑(V氯仿∶V正丁醇= 4∶1)，混合，振蕩，蛋白質(zhì)及有機(jī)相從分液漏斗下部除去。采用考馬斯亮藍(lán)比色法[6]測(cè)定溶液中蛋白質(zhì)的含量，以脫蛋白次數(shù)為變量，測(cè)定3、4、5次操作后溶液中蛋白質(zhì)的含量。

1.2.6 凝膠色譜法純化、分級(jí)制備寡糖純品[7]

色譜條件：葡聚糖凝膠Sephadex G-25，色譜柱長(zhǎng)80 cm、直徑1.5 cm，流動(dòng)相為0.05 mol·L-1氯化鈉溶液，進(jìn)樣量 10 mL，流速0.3 mL·min-1，以DBS-100電腦全自動(dòng)部分收集器收集。

寡糖提取液經(jīng)活性炭脫色、Sevag法脫蛋白、5 BV 95%的乙醇沉淀、冷凍干燥后以水溶解，進(jìn)行凝膠柱層析。收集液以蒽酮-硫酸比色法確定寡糖的部位，合并寡糖部位收集液，濃縮醇沉，離心，冷凍干燥，計(jì)算寡糖回收率，用蒽酮-硫酸比色法測(cè)定產(chǎn)品純度。

1.2.7 提取樣品中寡糖含量的測(cè)定

取1 mL樣品提取液置于100 mL容量瓶，蒸餾水定容至刻度，取1 mL置10 mL具塞試管中，加入0.2%蒽酮試劑4.0 mL，冰水浴冷卻，具塞煮沸10 min，自來(lái)水冷卻。室溫放置10 min，以試劑空白為參比，在620 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

2 結(jié)果與討論

2.1 新鮮黃皮洋蔥含水量及寡糖含量

經(jīng)測(cè)定，新鮮黃皮洋蔥含水量為90.75%、寡糖含量為4.09%。

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 溶劑的選擇

寡糖是極性分子，可采用極性溶劑水或強(qiáng)極性的鹽溶液作提取溶劑。將50 g洋蔥勻漿液在料液比為1∶4、提取時(shí)間為90 min、提取溫度為70℃的條件下，以不同的溶劑(0.8 mol·L-1鹽水溶液)進(jìn)行提取，考察其對(duì)洋蔥寡糖提取率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 溶劑對(duì)寡糖提取率的影響

由圖2可知，溶劑對(duì)提取率的影響不大，強(qiáng)極性的鹽溶液和水作溶劑時(shí)，寡糖的提取率基本相當(dāng)，說(shuō)明水的極性已能滿足完全提取寡糖的要求。故確定洋蔥寡糖的提取溶劑為水。

2.2.2 提取次數(shù)的確定

以水為溶劑，將50 g洋蔥勻漿液在料液比為1∶4、提取時(shí)間為90 min、提取溫度為70℃的條件下進(jìn)行提取，考察提取次數(shù)對(duì)寡糖提取率的影響，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 浸提次數(shù)對(duì)寡糖提取率的影響

由表2可知，提取2次時(shí)寡糖提取率為5.65%，提取基本完全。因此，確定提取次數(shù)為2次。

2.2.3 料液比的影響

以水為溶劑，將50 g洋蔥勻漿液在提取溫度為70℃、提取時(shí)間為60 min的條件下重復(fù)提取2次，考察料液比對(duì)寡糖提取率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 料液比對(duì)寡糖提取率的影響

由圖3可知，隨溶劑用量的增大，寡糖的提取率不斷上升；當(dāng)料液比達(dá)到1∶4后，提取率趨于穩(wěn)定。這是因?yàn)椋軇┯昧枯^小時(shí)，寡糖溶解不完全；隨著溶劑用量的增加，寡糖溶解浸出量增大；當(dāng)溶劑用量足夠溶解所有寡糖時(shí)，繼續(xù)增加溶劑用量，提取率變化不大。故選擇料液比為1∶(3～5)進(jìn)行正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

2.2.4 提取時(shí)間的影響

以水為溶劑，將50 g洋蔥勻漿液在提取溫度為70℃、料液比為1∶4的條件下重復(fù)提取2次，考察提取時(shí)間對(duì)寡糖提取率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 提取時(shí)間對(duì)寡糖提取率的影響

由圖4可知，提取時(shí)間越長(zhǎng)，寡糖提取率越高；提取90 min時(shí)提取率達(dá)到最大；之后提取率隨時(shí)間的延長(zhǎng)而下降。提取過(guò)程非常復(fù)雜，融合浸泡、擴(kuò)散、滲透、溶解、再擴(kuò)散、平衡等步驟，需要較長(zhǎng)的時(shí)間，但提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)造成提取液中部分寡糖分解，導(dǎo)致提取率下降。故選擇提取時(shí)間為70～90 min進(jìn)行正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

2.2.5 提取溫度的影響

以水為溶劑，將50 g洋蔥勻漿液在提取時(shí)間為60 min、料液比為1∶4的條件下重復(fù)提取2次，考察提取溫度對(duì)寡糖提取率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 提取溫度對(duì)寡糖提取率的影響

由圖5可知，寡糖提取率隨提取溫度的升高而上升；提取溫度為60℃時(shí)提取率達(dá)到最大；提取溫度高于60℃時(shí)，提取率反而降低。這是因?yàn)樘崛囟冗^(guò)高，會(huì)導(dǎo)致溶液中寡糖對(duì)熱的不穩(wěn)定性而分解。故選擇提取溫度為50～70℃進(jìn)行正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

2.3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析(表3)

由表3可知，各因素對(duì)洋蔥寡糖提取率的影響大小依次為B>C>A，最佳提取工藝條件是A2B2C3，即料液比1∶4 、提取時(shí)間80 min、提取溫度70℃，此時(shí)，洋蔥寡糖的提取率達(dá)70.19%。

2.4 洋蔥寡糖的分離純化

2.4.1 活性炭脫色

表3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)活性炭添加量(活性炭/提取液)為2.5 g·L-1、脫色時(shí)間為20 min、脫色溫度為70℃時(shí)，脫色率為85.48%、寡糖回收率為85.13%。

2.4.2 Sevag法脫蛋白

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)3、4、5次Sevag法脫蛋白后，寡糖提取液的蛋白質(zhì)含量由18.763 μg·mL-1分別降至9.246 μg·mL-1、1.269 μg·mL-1、0.997 μg·mL-1，表明經(jīng)4次Sevag法處理，即可完全去除蛋白質(zhì)。

2.5 凝膠色譜法制備寡糖純品(圖6)

由圖6可以看出，洋蔥寡糖在50～100 mL之間有單一對(duì)稱洗脫峰，寡糖的回收率為71.35%、純度為99.61%。

3 結(jié)論

(1)單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)表明，以水為溶劑提取洋蔥寡糖時(shí)，各因素對(duì)寡糖提取率影響大小依次為：提取時(shí)間>提取溫度>料液比。優(yōu)化的提取工藝條件為：料液比 1∶4(g∶mL)、提取溫度70℃、提取時(shí)間80min。在此條件下提取2次，寡糖提取率為70.19%。

圖6 Sephadex G-25柱層析

(2) 采用活性炭脫色，當(dāng)活性炭用量(活性炭/提取液)為2.5 g·L-1、脫色時(shí)間為20 min、脫色溫度為70℃時(shí)，脫色率為85.48%、寡糖回收率為85.13%。經(jīng)4次Sevag法處理可完全去除蛋白質(zhì)。5 BV的95%乙醇可使寡糖沉淀完全。

(3) 經(jīng)葡聚糖凝膠Sephadex G-25柱層析純化分級(jí)，寡糖回收率為71.35%、純度為99.61%。

[1] 汪世華，彭利民，張會(huì)，等.低聚果糖的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用[J].中國(guó)乳品工業(yè)，2002，30(2)：31-34.

[2] 馮長(zhǎng)根，吳悟賢，劉霞，等.洋蔥的化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展[J].中國(guó)中醫(yī)藥雜志，2003，37(7)：63-65.

[3] 王寶維，王利華，劉光磊，等. 圓蔥寡糖對(duì)肉雞生長(zhǎng)發(fā)育及免疫功能的影響[J].飼料研究，2004，(2)：1-3.

[4] 王寶維，葛文華，史美麗，等. 圓蔥寡糖、海藻膠對(duì)肉雞生長(zhǎng)影響的研究[J]. 萊陽(yáng)農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào)，2001，18(4)：309-312.

[5] 劉云.當(dāng)歸多糖的提取及含量測(cè)定[J].現(xiàn)代中藥研究與實(shí)踐，2003，17(1)： 49-53.

[6] 董潔，郭立瑋，文紅梅，等.中藥水提液中蛋白質(zhì)含量測(cè)定方法研究[J]. 現(xiàn)代中藥研究與實(shí)踐，2009，23(6)： 40-43.

[7] 郝林華，陳磊，仲娜，等.牛蒡寡糖的分離純化及結(jié)構(gòu)研究[J].高等學(xué)校化學(xué)學(xué)報(bào)，2005，26(7)：1242-1247.