LC-MS/MS測定糧食中黃曲霉毒素B1的方法

孫莉，周玉，余義，董孝元，汪明迪，唐艷榮

1.黃鶴樓酒業有限公司（武漢 430050）；2.湖北信嘉檢測科技有限公司（咸寧 437000）；3.武漢雅仕博科技有限公司（武漢 430000）

黃曲霉毒素B1（Aflatoxin B1，簡寫為AFB1）是二氫呋喃氧雜萘鄰酮的衍生物，含有一個雙呋喃環和一個氧雜萘鄰酮（香豆素）。黃曲霉毒素B1是已知的化學物質中致癌性最強的一種。黃曲霉毒素B1對包括人和若干動物具有強烈的毒性，其毒性作用主要是對肝臟的損害。

在天然食物中以黃曲霉毒素B1最為多見，危害性也最強，國家質檢總局規定黃曲霉毒素B1是大部分食品的必檢項目之一。

據相關研究表明，黃曲霉毒素毒性強，且不易分解，能損傷人的肝臟，臨床表現有胃部不適、食欲減退、惡心嘔吐、腹脹及肝區觸痛等[1]。目前，關于黃曲霉毒素B1的檢測方法主要有液相色譜-質譜聯用法[2]、柱后衍生法[3]、高效液相色譜熒光檢測法[4]、免疫層析法[5]、酶聯免疫吸附（ELISA）與高效液相色譜（HPLC）法[6]、高通量自動化免疫磁珠凈化-超高效液相色譜法[7]。

此次試驗通過不斷試驗簡化樣品前處理方法，使分析方法更加簡便快捷，在保證準確性的同時縮短檢測時間，提高分析效率。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乙腈、甲醇（色譜純，美國Baker公司）；乙酸銨（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；水（二級水，德國默克密理博MiLLi-QDireat）；AFT B1標準品（C17H12O6，CAS：1162-65-8，純度≥98%，質量濃度為100 μg/mL）。

1.2 儀器與設備

Agilent 1 260 LC-Agilent 6 460安捷倫三重串聯四極桿質譜儀、Agilent ZORBAX RX-C18安捷倫色譜柱（2.1×150 mm，1.8 μm），安捷倫公司；孔徑0.22 μm有機濾膜、1 000 mL全玻璃微孔過濾器，天津津騰。

1.3 試法

1.3.1 標準溶液配制

標準儲備溶液（10 μg/mL）：準確移取1 mL標準品溶液（100 μg/mL），用乙腈溶解并定容至10 mL。

標準工作液（100 ng/mL）：準確移取1 mL標準儲備液（10 μg/mL）至100 mL容量瓶中，用乙腈定容。

標準系列工作溶液：準確移取5，1，50，100，200，500，800和1 000 μL標準工作液（100 ng/mL）至10 mL容量瓶中，用流動相定容至刻度，配制質量濃度為0.05，0.1，0.5，1.0，2.0，5.0和8.0 ng/mL的系列標準溶液。

1.3.2 樣品制備

為保證樣品具有代表性、均一性，在采集樣品時，采樣量需大于1 kg，將采集的樣品采用四分法，將樣品均勻分配，取其中兩份樣品，用高速粉碎機將其粉碎，過篩，儲存于樣品瓶中，密封保存，供檢測用。

1.3.3 樣品提取

稱取5 g（精確至0.01 g）試樣于50 mL離心管中，加入20.0 mL經在-10 ℃下冷凍30 min的乙腈-水溶液（84+16，V/V），振蕩混合后靜置30 min，在5 000 r/min下離心10 min，取上清液備用。

1.3.4 樣品凈化

準確移取4 mL上清液備用，將制備好的上清液用定量濾紙進行過濾，待濾紙內的液體流盡后，往濾紙內加入10 mL水進行沖洗，待水溶液過濾完后，再加入10 mL甲醇溶液進行洗脫，收集全部洗脫液至試管中。在50 ℃下用氮氣緩緩地將洗脫液吹至近干（切記不能將溶液吹干），加入1.0 mL流動相，渦旋振蕩1 min溶解殘留物，再經0.22 μm濾膜過濾，收集濾液存放至進樣瓶中以備上機檢測。

1.3.5 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX RX-C18色譜柱（2.1 mm×150 mm，1.8 μm）；流動相A為5 mmol/L乙酸銨溶液，流動相B為乙腈；流動相A與B體積比30∶70；流速：0.3 mL/min；柱溫箱：40 ℃；進樣量：5 μL。

1.3.6 質譜條件

2 結果與討論

2.1 色譜條件和質譜條件的優化

2.1.1 色譜條件的優化

通過對黃曲霉毒素B1物理和化學信息的分析，分別以0.1%甲酸-甲醇、0.1%甲酸-乙腈、5 mmol/L乙酸銨-乙腈、5 mmol/L乙酸銨-甲醇作為流動相進行樣品分離。由于不同流動相的pH不同，對色譜柱中的填料物質會起到一定的作用，有的流動相有利于目標物質的分離，有的流動相則會抑制目標物出峰，導致峰形異常，如峰拖尾、峰前伸、雙頭峰以及鬼峰等現象，均不利于對樣品進行定性以及定量分析。通過利用以上流動相對黃曲霉毒素B1進行色譜峰分離，結果表明，用5 mmol/L乙酸銨-乙腈作為流動相時物質分離度、峰形、響應值以及保留時間的穩定性均優于其他流動相，最終選用5 mmol/L乙酸銨-乙腈為流動相進行洗脫。黃曲霉毒素B1在優化的色譜和質譜條件下的MRM色譜圖如圖1所示。

圖1 AFT B1子離子掃描圖

表1 離子源控制條件

2.1.2 質譜條件的優化

將液相部分色譜柱換為兩通連接，采取直接進樣的方式，將配制的純品目標物標準溶液注入質譜，分別進行正離子模式和負離子模式，在Scan狀態下進行全掃描檢測，得到TIC總離子流圖（見圖2），根據總離子流圖標記出特征離子峰，即得到一級質譜圖和準分子離子峰，再進行SIM模式掃描，將標記出的準分子離子峰進行單獨掃描，得到EIC提取離子流圖。再用碰撞氣惰性氣體氮氣攻擊該前體離子，獲得其二級質譜圖及相應的子離子。結果表明，在正離子模式下響應值及靈敏度均高于負離子模式，因此，選擇正離子電離模式。利用多反應監測模式（MRM）對選定的定性離子和定量離子對裂解電壓、毛細管電壓、碰撞能、保留時間、碰撞池加速電壓等質譜參數進行優化，使各監測離子豐度和信號達到最佳。

圖2 SCAN模式下掃描色譜圖

通過設置Precursor Ion模式對母離子進行確認，確定AFT B1質荷比313作為母離子；再通過設置Prodμct Ion模式，利用碰撞池電壓對母離子進行轟擊，得到相應的子離子碎片，選擇其中離子豐度高的離子作為子離子，且每種化合物的質譜定性離子必須出現，至少應包括一個母離子和兩個子離子。通過設置，確定AFT B1質荷比285和241作為子離子。目標化合物質譜離子圖見圖3。

圖3 目標化合物質譜離子圖

經過以上質譜條件設置，最終明確采用正離子模式采集，該模式下的質譜分析參數見表2，質譜圖見圖4。

圖4 液相色譜-質譜圖

表2 離子選擇參數表

表3 AFT B1標準曲線線性相關系數

2.2 線性范圍、檢出限和定量限

2.2.1 標準曲線

將氨基甲酸乙酯標準儲備液用一級水稀釋，分別配制成0.05，0.1，0.5，1.0，2.0，5.0和8.0 ng/mL的標準工作液，按1.3小節所述的色譜-質譜條件進行測定，繪制標準工作曲線，如圖5所示。

圖5 標準曲線峰面積比值-濃度圖

由圖5可知，以AFT B1與對應峰面積-濃度作圖，得到標準曲線回歸方程，其線性相關系數為0.998，根據方法驗證學要求，線性相關系數應大于0.99，故該方法線性滿足標準要求。

2.2.2 定性測定

為保證樣品在色譜保留時間穩定，便于在復雜基體中快速判定物質出峰位置，作初步定性分析，故在同一批處理中，樣品中黃曲霉毒素B1出峰時間與標準點出峰時間相比較，變化范圍應在±2.5%之內。見圖6。

圖6 目標化合物色譜峰的保留時間圖

由圖6可知，同一批處理中標準色譜峰的保留時間為10.306 min，試樣中目標化合物色譜峰的保留時間為10.268 min，其變化范圍為0.37%，小于2.5%，符合標準要求。

2.2.3 方法檢出限和定量限

參考GB/T 27417—2017《合格評定 化學分析方法確認和驗證指南》[21]中5.4小節檢出限和定量限的評定方法規定，采用信噪比法評估檢出限和定量限，檢出限可接受的信噪比為3∶1，定量限可接受的信噪比為10∶1。為保證實用性，模擬黃曲霉毒素B1在谷物中的狀態，選擇高粱為基質，然后在高粱樣品中添加黃曲霉毒素B1標準儲備液，進行方法探底試驗。既要保證信噪比可接受，也要保證峰形易識別，且峰形無異常，如圖7所示。

圖7 定量限和檢出限信噪比圖

由圖7可知，當稱取樣品5 g時，AFT B1濃度為0.01 μg/kg，峰形易識別且信噪比rSN為73.8，大于3。AFT B1濃度為0.05 μg/kg，峰形易識別且信噪比rSN為83.1，大于10。該方法在滿足國標要求的檢出限和定量限的同時，峰形易識別，便于樣品結果的定性定量分析。

2.2.4 精密度和準確度

按照谷類中黃曲霉毒素B1的檢測要求，選擇常見及常用谷物高粱作為基體檢測，在高粱中加入AFT B1標準溶液，分別配制成低中高3種濃度的加標樣品溶液，按照給定分析方法的全過程進行處理和測定，記錄6個平行樣的測定結果，按全程序每個樣品平行測定6次，分別計算每個樣品的加標回收率，統計其相對標準偏差。見表4。加標回收率按式（1）計算。

表4 AFT B1精密度和加標回收率

由表4可知，此試驗中檢測結果的相對標準偏差均小于10%，且加標回收率均在95%~115%之間，滿足標準方法使用要求。

2.3 與國標法比對

選擇常見的四種不同類型糧食高粱、小麥、玉米、大米添加黃曲霉毒素B1，將該方法與GB 5009.22—2016《食品安全國家標準 食品中黃曲霉毒素B族和G族的測定》[22]方法進行加標測回收率結果比對，比對結果見表5。

表5 方法結果比對

將該方法和國標方法的數據進行比較，兩組數據的絕對偏差小于1，相對偏差小于10%。結果表明，該方法可以用于糧食中黃曲霉毒素B1的檢測。

3 結論

此研究利用液相色譜-質譜聯用儀分析了糧食中黃曲霉毒素B1化合物的分子信息，利用多反應監測模式的液相色譜-質譜聯用儀技術，建立了一個快速、穩定、靈敏的可定性定量的檢測方法。該方法可在15 min內完成，其檢測范圍內線性良好（r=0.998）。檢出限0.01 μg/kg，定量限0.05 μg/kg，精密度小于6%，回收率均在95%~115%之間。相比于國標方法，該方法在前處理方面從樣品制備、提取、凈化，進行了改良，在保證結果準確的前提下，簡化前處理步驟，縮減前處理時間，大大縮短了方法檢測時間，同時在耗材方面也是大大節約了資源。綜上所述該方法可以對糧食中黃曲霉毒素B1進行實際的定性定量檢測。