PLptn真核載體的構建表達及其趨化活性測定

柳 超,蔣朋飛,曹金鎖,張德禮

(西北農林科技大學動物醫學院病毒免疫與生物信息研究室,陜西楊凌712100)

趨化因子是一種能夠趨化和活化白細胞的細胞因子,在炎癥和免疫反應中發揮著重要的作用,現在發現的趨化因子有CXC,CC,CX3C和 C共四族。淋巴細胞趨化因子(Lptn)為趨化因子C家族成員,可由CD8+T細胞、NK細胞、肥大細胞、嗜酸性粒細胞、γ δ T 細胞等多種細胞產生,主要作用于 CD4+T細胞、CD8+T細胞、NK 細胞、B細胞、中性粒細胞等[1]。Lptn的結構、功能等在人及小鼠中研究較為深入,目前人和小鼠的Lptn單克隆抗體已實現商品化生產。Zavala-Flores L M等[2]已成功用乳酸桿菌表達了人淋巴細胞趨化因子,并在體外做了活性驗證,而Lptn的研究在豬體內卻未見相關報道。為此本研究構建了豬淋巴細胞趨化因子(PLptn)真核表達載體,并轉染至豬臍靜脈血管內皮細胞系(SUVEC),在體外測定了其趨化生物學活性,為進一步研究其功能奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 試劑和材料 T rizol Reagent試劑、Lipofectamine TM 2 000購自Invitrogen公司,RT-PCR反轉錄試劑盒購自Fermentas公司,premix Taq DNA聚合酶、限制性內切酶以及T4 DNA連接酶購自 TaKaRa寶生物工程(大連)有限公司,Anti-GFP Antibody購自天根生物科技有限公司,羊抗鼠IgG/HRP購自北京博奧森生物科技有限公司,DMEM細胞培養基購自Gibco公司,6孔細胞培養板購自Costar公司,Western blot所用聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride,PVDF)為美國Millipore生產。

1.2 方法

1.2.1 豬胸腺組織總 RNA提取 T rizol法從健康成年長白豬胸腺組織中提取總RNA。

1.2.2 PLptn cDNA的獲得 按常規的 RT-PCR方法進行,根據GenBank登錄號為NM_001134345序列設計引物,序列如下 Upper:5′-CGCAAGCTTCCATGAGACT TCTCATC-3′,Lower:5′-TAGGATCCCTACCCAGTCAGGGT T-3′。PCR 總 體系為 25 μ L,反應體系如下 :12.5 μ L Taq DNA polymerase,上下游引物(20 pmol)各 0.5 μ L,1.25 μ L反轉錄產物,10.25 μ L ddH2O。反應參數為:95℃5 min,30個循環(94℃30 s,56℃30 s,72℃30 s),最后72℃延伸10 min。

1.2.3 真核載體pEGFP-PLptn的構建 PCR產物純化后與pMD-18T載體連接,構建亞克隆載體pMD-18T-PLptn,轉化 DH5α感受態細胞,經氨芐抗性篩選、測序及雙酶切對重組菌進行鑒定。將正確的目的基因連接至pEGFP-C1中,構建真核載體pEGFP-PLptn。

1.2.4 真核載體pEGFP-PLptn轉染SUVEC 抽提真核載體pEGFP-PLptn,紫外分光光度計測定其濃度和純度。將SUVEC細胞接種到6孔培養板上,待細胞 80%～90%融合時,按 LipofectamineTM 2 000說明進行轉染,48 h后觀察熒光強度。

1.2.5 PLptn Western blot檢測 轉染后48 h收集細胞,裂解抽提蛋白,樣品處理后,進行Western blot檢測。首抗為小鼠單克隆抗體Anti-GFP antibody(1∶2 000),二抗為 HRP標記的抗鼠二抗Goat Anti-mouse IgG/HRP(1∶3 000)。

1.2.6 趨化試驗 通過檢測豬外周血液中的淋巴細胞的遷移來反映Pig Lptn活性,結果以趨化指數表示。

2 結果與分析

2.1 總RNA濃度和純度 紫外分光光度計測定提取總RNA的濃度和純度,結果為OD260/OD280=1.84±0.01,OD260/OD230=1.32±0.01,RNA 的濃度為66±0.01 ng/μ L。

2.2 PLptn cDNA的獲得 以從健康成年長白豬胸腺組織中提取總RNA反轉錄得到的cDNA為模板,擴增出PLptn編碼基因全長序列,結果見圖1。

2.3 測序結果 測序結果經比對軟件Bioxm2.6分析,所得序列與GenBank登錄號為NM-001134345序列完全一致。

圖1 PLptn的PCR擴增

2.4 pEGFP-PLptn轉染SUVEC結果 紫外分光光度計測定質粒pEGFP-PLptn和pEGFP-C1的濃度和純度,結果為 pEGFP-C1:OD260/OD280=1.94±0.01,OD260/OD230=2.27±0.01,濃度為378.8±0.01 ng/μ L;pEGFP-PLptn:OD260/OD280=1.93 ±0.01,OD260/OD230=2.35±0.01,濃度為438.2±0.01 ng/μ L。利用熒光倒置顯微鏡對轉染pEGFP-PLptn質粒的SUVEC觀察,發現轉染pEGFP-PLptn后48 h熒光表達量最多,見圖2-3、2-4,圖2-1、2-2為pEGFP-C1轉染48 h后結果。

圖2 pEGFP-C1和 pEGFP-PLptn轉染SUVECs后的熒光顯微鏡檢測(100×)

2.5 PLptn在SUVEC中表達的檢測 Western blot結果顯示重組載體樣品表達約43 ku的蛋白,而空載體pEGFP-C1表達自身約33 ku的蛋白,說明構建的重組質粒pEGFP-PLptn在SUVEC中成功表達,PLptn基因編碼的蛋白大約10 ku,與已知相符,結果見圖3。

圖3 Western blot檢測PLptn的表達

2.6 趨化試驗結果 用pEGFP-PLptn轉染細胞系SUVEC,趨化試驗檢測融合蛋白對豬外周血淋巴細胞的趨化活性,結果如下:趨化游走距離(A):32 μ m,自發游走距離(B):11 μ m,趨化指數(A/B)為2.9。表明PLptn能在SUVEC中表達,而且表達的PLptn具有趨化豬外周血淋巴細胞的生物學活性。

3 討論

Lptn在調節免疫系統平衡、增強黏膜免疫、抗腫瘤等方面都發揮重要作用,臨床上與腎炎、移植排斥、病毒感染、過敏性哮喘等多種疾病相關[3]。對其功能和作用機制的研究已相對成熟。PLptn編碼由110個氨基酸殘基組成的多肽,該多肽序列含Chemokine-C 、Chemokine、Chemokine-CC 和 SCY 等功能域,與羊和人的氨基酸序列相似率分別為81.6%和68.4%[4]。具有相似序列的蛋白質具有相似的功能,又PLptn具有與Lptn相同的結構域Chemokine-C,這提示我們PLptn可能具有上述和人淋巴細胞趨化因子Lptn相似的功能。這為研究PLptn的功能和作用機制提供了一種思路,我們可以參考Lptn的研究方法來研究PLptn的功能。本試驗成功克隆了豬淋巴細胞趨化因子編碼基因全長序列。構建了pMD-18T-PLptn和真核載體pEGFPPLptn,經鑒定均無誤。轉染細胞Western blot結果顯示,目的基因已成功表達,體外趨化活性試驗檢測融合蛋白對豬淋巴細胞具有趨化活性,為研究PLptn生物學功能奠定了基礎。

[1]Ordway D,Henao-Tamayo M,Smith E,et al.XCL1(lymphotactin)chemokine produced by activated CD8(+)T cells during the chronic stage of infection with My cobacterium tuberculosis negatively affects production of IFN-gamma by CD4(+)T cells and participates in g ranuloma stability[J].Leukoc Biol,2007,82(5):1221-1229.

[2]Zavala-Flores L M,Villatoro-Hernandez J,Gamez-Escobedo A,et al.Production of biologically active human lymphotactin(XCL1)by Lactococcus lactis[J].Biotechnol Lett,2009,31(2):215-220.

[3]Zhu C F,OU Z L.Research Progress of Lymphotactin(Ltn)[J].Foreign Medical Sciences:Section of Pathophysiology and Clinical Medicine,2002,22(4):320-322.

[4]宋豪,張德禮.豬淋巴細胞趨化因子XCL1的電子克隆和編碼區序列RT-PCR驗證[J].動物醫學進展,2008,12:11-16.

[5]Blaschke S,Brandt P,Wessels J T,et al.Expression and Function of the C-Class Chemokine Lymphotactin(XCL1)in Wegener′s G ranulomatosis[J].J Rheumatol,2009,36(11):2491-2500.

[6]Rosas-T araco A G,Higgins D M,Sánchez-Campillo J,et al.Intrapulmonary delivery of XCL1-targeting small interfering RNA in mice chronically infected with Mycobacterium tuberculosis[J].Am J Respir Cell Mol Biol,2009,41(2):136-145.