長(zhǎng)春新堿對(duì)犬乳腺癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響

李成葉,邱昌偉,,王金秋,林德貴

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,湖北武漢430070;2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,北京海淀100193)

犬乳腺腫瘤在獸醫(yī)臨床中非常常見(jiàn),母犬乳腺瘤發(fā)病率約占全部腫瘤性疾病的25%～42%[1]。其早期治療主要依靠外科切除的方法,但對(duì)已經(jīng)轉(zhuǎn)移的犬乳腺腫瘤,通過(guò)手術(shù)切除后也可能復(fù)發(fā)。為延長(zhǎng)患病犬的生命,我們可以選用化療藥物來(lái)抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。長(zhǎng)春新堿(vincristine,VCR)是常用的抗腫瘤藥物,現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)可以抑制一些人腫瘤細(xì)胞的增殖[2-3],并可以影響一些細(xì)胞的周期[4-5]。VCR是否對(duì)體外培養(yǎng)的犬乳腺癌細(xì)胞有抑制作用,國(guó)內(nèi)還未見(jiàn)有這方面的報(bào)道,為此,我們進(jìn)行了這方面的研究。

1 材料與方法

1.1 材料 體外培養(yǎng)的犬乳腺癌細(xì)胞(CMT1211):由本研究原代培養(yǎng)并通過(guò)鑒定;長(zhǎng)春新堿:購(gòu)自廣州白云山明興制藥有限公司,批號(hào)050903,用 PBS配成 4 μ g/mL儲(chǔ)存液;M TT 和DMSO均購(gòu)自Sigma公司;六孔培養(yǎng)板:Costar公司;胎牛血清:Hyclone;公司流式細(xì)胞儀:美國(guó)B-D公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞增殖抑制試驗(yàn) 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞,按 0.5×104/孔于 200 μ L培養(yǎng)液中接種 96孔板,在37℃、5%CO2條件下過(guò)夜后,加入不同濃度的VCR,對(duì)照組加入相應(yīng)體積的PBS,每組設(shè)4個(gè)平行孔。用藥后再分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h,每孔加入20 μ L MT T(5 mg/mL)后再培養(yǎng) 4 h,傾去培養(yǎng)液,每孔加入 100 μ L DMSO 溶解,待完全溶解后,于酶標(biāo)免疫測(cè)定儀上以波長(zhǎng)為490 nm,測(cè)定其吸光度(重復(fù)3次試驗(yàn))。根據(jù)公式:細(xì)胞增殖抑制率(%)=(1-處理組的吸光度/對(duì)照組吸光度)×100%,計(jì)算出抑制率。

1.2.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡 將吹打均勻的犬乳腺癌細(xì)胞(CM T1211)平均接種到6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,24 h后換培養(yǎng)液。分別用 0.5 μ g/mL 、1 μ g/mL 、2 μ g/mLVCR 作用于細(xì)胞 6 h 、12 h、24 h后,觀察細(xì)胞的形態(tài),用0.02%胰酶-EDTA將培養(yǎng)孔中的細(xì)胞消化,0.01 mol/L pH 7.4的PBS緩沖液洗2次,1 000 r/min離心8 min,用300 μ L 0.01 mol/L pH 7.4的PBS緩沖液制成懸浮的單細(xì)胞懸液,再將700 μ L 100%冷乙醇緩慢加入,固定細(xì)胞,使乙醇的濃度最終為70%,置于4℃冰箱保存至少固定 18 h。完全去除乙醇后,0.01 mol/L pH 7.4的PBS緩沖液清洗固定的細(xì)胞懸液2次,1 000 r/min離心10 min。在細(xì)胞懸液中加入PI染色液使之濃度為50 μ g/mL,37℃作用 30 min,于流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡,每組均重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件中的方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 細(xì)胞增殖抑制試驗(yàn)結(jié)果 不同濃度的VCR處理CM T1211細(xì)胞,由表1可知,隨濃度增加其抑制率增加(P＜0.01)。

2.2 細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的檢測(cè)結(jié)果 由表2可知,在同一時(shí)間內(nèi),各藥物濃度的G0/G1、G2/M 分別與對(duì)照組比較,差異不顯著(P＞0.05),但細(xì)胞凋亡率隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而增加(P＜0.01);同一濃度內(nèi),不同處理時(shí)間的G0/G1、G2/M 與對(duì)照組相比較,差異亦不顯著(P＞0.05),隨著VCR濃度的增強(qiáng),細(xì)胞凋亡率也在增加(P＜0.01)。

表1 MTT法測(cè)定VCR對(duì)CMT1211細(xì)胞的影響

3 討論

細(xì)胞凋亡最早由Kerr等根據(jù)形態(tài)表現(xiàn)而命名的,它是細(xì)胞死亡方式之一,具有特殊形態(tài)改變的程序性死亡方式[6]。細(xì)胞凋亡后從形態(tài)到功能等都發(fā)生一系列的變化,具有共同的基本特征[7-8]。目前腫瘤化療策略主要集中于抑制腫瘤細(xì)胞增殖或/和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡是多種因素控制的主動(dòng)性細(xì)胞死亡過(guò)程,在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中,凋亡起著很重要的作用。細(xì)胞凋亡為腫瘤防治提供了新的思路,現(xiàn)在研究發(fā)現(xiàn)很多抗癌藥物能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[9]。長(zhǎng)春新堿(VCR)是1962年由長(zhǎng)春花中提出的二聚吲哚類化合物,主要存在于長(zhǎng)春花葉中[10],臨床上用于治療急性淋巴細(xì)胞白血病、何杰金及非何杰金淋巴瘤有確切療效。有關(guān)VCR抗腫瘤作用在人醫(yī)方面的報(bào)道比較多,但在臨床獸醫(yī)中還未見(jiàn)有報(bào)道,為此我們?cè)囵B(yǎng)了1株犬乳腺癌細(xì)胞系,該細(xì)胞系現(xiàn)已穩(wěn)定傳了接近80代,細(xì)胞性狀穩(wěn)定,呈典型的上皮樣貼壁生長(zhǎng),我們將其命名為CMT1211[11]。

表2 不同濃度的VCR處理CMT1211細(xì)胞不同時(shí)間對(duì)細(xì)胞周期及凋亡的影響

VCR主要是通過(guò)抑制細(xì)胞微管蛋白聚集和干擾細(xì)胞蛋白質(zhì)、脂類、氨基酸及核酸代謝而起抗癌作用[12]。在細(xì)胞增殖周期中,在G1期和S期之間以及G2期和M期之間,存在著影響細(xì)胞周期進(jìn)行的控制點(diǎn),而藥物可能通過(guò)調(diào)控這些控制點(diǎn)來(lái)影響細(xì)胞增殖。不同的化療藥物可影響細(xì)胞周期的不同階段 。而我們的試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),0.5 μ g/mL 、1 μ g/mL 、2 μ g/mL VCR分別處理CMT1211細(xì)胞后,其 G0/G1、G2/M 期細(xì)胞變化不明顯。此結(jié)論與唐旭東等報(bào)道-隨著VCR濃度的升高和作用時(shí)間的延長(zhǎng)G0/G1期細(xì)胞明顯下降、G2/M期細(xì)胞明顯升高不一致[12]。本試驗(yàn)通過(guò)FCM分析,揭示了VCR這種藥物具有誘導(dǎo)犬乳腺癌細(xì)胞凋亡的作用,且此作用與藥物的濃度和作用時(shí)間有關(guān)。但是本試驗(yàn)僅從VCR誘導(dǎo)犬乳腺腫瘤細(xì)胞凋亡一個(gè)方面做了研究,有關(guān)VCR抗犬乳腺腫瘤作用的其他方面還有待于進(jìn)一步研究。

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