六神丸抗腫瘤血管生成的實驗研究

孫莉

新生血管既是惡性腫瘤快速增長所必須的先決條件，亦是惡性腫瘤向遠處轉移的一個主要步驟和渠道，以腫瘤血管形成為靶點的抗轉移研究己成為基礎和臨床研究的熱點，阻斷腫瘤血液輸送，防治腫瘤新生血管形成的血管生成抑制劑為抗腫瘤生長及轉移藥物研究提供了新的方向。六神丸是臨床治療腫瘤的有效復方，本實驗選擇六神丸作為研究對象，擬研究其在腫瘤新生血管的生成中作用。

1 材料與方法

1.1 細胞系 MCF-7人乳腺癌瘤株，購自山東大學醫學院細胞生物學教研室。

1.2 主要試劑及試劑盒 鼠抗人VEGF單克隆抗體(北京岳泰生物公司)，鼠抗人MMP-9單克隆抗體(北京岳泰生物公司)。

1.3 動物含藥血清制備及實驗分組 Wistar大鼠20只，雄性，體重(200±20)g。隨機分為空白血清組(對照組)8只，含藥血清制備組12只。含藥血清組每日給予六神丸溶液(5 mg/ml)3ml/次，2次/d灌胃，空白血清組每日給予等量生理鹽水灌胃，于給藥第3天，于末次灌藥前12 h禁食，末次給藥后1 h，乙醚麻醉，腹主動脈采血，無菌分離血清，經56℃、30 min滅活處理，用0.22μm微孔濾膜過濾除菌后分裝，分裝入小瓶，置-20℃冰箱保存備用。實驗分組，見表1。

表1 實驗分組情況

1.4 細胞培養 復蘇人乳腺癌細胞系MCF-7細胞，接種于50 ml培養瓶，加入DMEM培養液(含10%小牛血清，青、鏈霉素各100 u/ml)8 ml，置于37℃、飽和濕度、含5%CO2的細胞培養箱中無菌培養，細胞呈貼壁生長。至細胞生長旺盛貼壁后，去掉原培養液，分別加入以上各對照組、實驗組含藥血清，于培養箱中繼續培養24 h，制備單細胞懸液，加入鼠抗人VEGF單克隆抗體或鼠抗人MMP-9單克隆抗體，上流式細胞儀檢測。

2 結果

2.1 六神丸對人乳腺癌MCF-7細胞的VEGF表達的影響，見表2。

表2 六神丸對人乳腺癌MCF-7細胞的VEGF熒光表達強度的影響

從上表可以得出:對照組(10%正常鼠血清組)及各處理組細胞培養24 h后，各處理組VEGF熒光表達強度水平均有所下降，六神丸含藥血清組下降明顯，20%含藥鼠血清組較10%含藥鼠血清組更為明顯;DDP+10%正常鼠血清組較之對照組也有明顯下降，但不及六神丸含藥鼠血清組;DDP+10%含藥鼠血清組的熒光表達強度最低。VEGF熒光表達圖顯示:對照組的VEGF熒光表達強度波峰顯著右移，熒光強度高，經各含藥血清作用后，VEGF的熒光表達強度波峰顯著左移，DDP+10%含藥鼠血清組波峰左移最為明顯，熒光強度值顯著下降。

2.2 六神丸對人乳腺癌MCF-7細胞的MMP-9表達的影響，見表3。

表3 六神丸對人乳腺癌MCF-7細胞的MMP-9熒光表達水平的影響

從上表可以得出:對照組(10%正常鼠血清組)及各處理組細胞培養24 h后，各處理組MMP-9熒光表達強度水平均有所下降;六神丸含藥血清組下降明顯，20%含藥鼠血清組較10%含藥鼠血清組更為明顯;DDP+10%正常鼠血清組熒光表達強度較對照組明顯下降，但不及10%及20%含藥鼠血清組下降明顯;DDP+10%含藥鼠血清組的熒光表達強度最低。熒光表達圖顯示:對照組的MMP-9熒光表達強度波峰顯著右移，熒光強度高，經各含藥血清作用后，MMP-9的熒光表達強度波峰顯著左移，DDP+10%含藥鼠血清組波峰左移最為明顯，熒光強度值顯著下降。

結果表明:各處理組VEGF及MMP-9熒光表達強度明顯下降，與正常鼠血清組比較差異顯著;六神丸含藥鼠血清對MCF-7細胞VEGF及MMP-9熒光表達有明顯抑制作用，且隨藥血清濃度升高抑制作用增強;DDP+10%含藥鼠血清組的抑制作用最強，說明含藥鼠血清與DDP合用有增效作用。

3 結論

正常情況下血管內皮細胞是穩定的，當受到生理或病理的刺激如創傷、缺氧或腫瘤生長時開始增生以形成新的血管。新生血管形成包括毛細血管內皮層下基底膜降解、內皮細胞遷移和增殖、新生血管形成和新的基底膜形成等一系列過程。腫瘤血管生成必須依賴于瘤細胞、間質細胞、巨噬細胞及周圍宿主細胞分泌相關的血管生成活性因子誘導刺激內皮細胞增殖、遷移，導致血管新生。新血管的形成、發展及調節取決于血管生成促進因子(正調節)和血管生成抑制因子(負調節)之間的平衡。當促進血管生成的正調節因子占優勢時，就導致血管增生，反之就被抑制。在正常組織中，血管形成是受到嚴格調控的，由于血管新生的正負調節因子處于平衡狀態，即促血管生長因子被高水平的血管生成抑制因子嚴格控制，血管生成的開關處于關閉狀態，血管內皮細胞維持穩定。腫瘤細胞誘導血管形成是通過改變血管生成因子和血管抑制因子之間的平衡來實現的。一旦平衡遭到破壞，導致腫瘤組織中生長因子過度表達，抑制因子表達過低，腫瘤血管生成的開關將被打開，使得腫瘤組織完全傾向于血管生成一方，最終導致腫瘤的浸潤和轉移。VEGF是一種高度特異的血管內皮細胞有絲分裂素，也是目前己知作用最強的促血管內皮細胞增殖的細胞因子。MMP-9是MMPs家族中分子量最大的酶，其主要功能是降解細胞外基質中起骨架作用的主要成分，在腫瘤介導的細胞外基質降解中起關鍵作用。因此，MMP-9與VEGF協同表達可作為血管生成與腫瘤侵襲轉移的標志。

本實驗以流式細胞計數法測定 MCF-7細胞 VEGF、MMP-9表達。結果顯示，六神丸含藥鼠血清能顯著抑制VEGF、MMP-9的表達，高濃度的鼠藥血清優于低濃度血清組，DDP單用能顯著下調VEGF、MMP-9表達，但不及六神丸鼠藥血清組，而DDP+10%六神丸鼠藥血清組抑制作用最明顯。六神丸是攻毒法的代表方劑，是臨床治療腫瘤的有效復方。選擇六神丸作為研究對象，從抗腫瘤血管生成方面立意，探討其抗腫瘤作用的機理，豐富了六神丸在腫瘤治療中的內涵，對腫瘤的臨床治療有重要的指導意義。