干擾素-γ聯合順鉑對人骨肉瘤細胞U-2OS增殖抑制作用的研究

張先鋒 呂智 馮毅

骨肉瘤是一種常見于兒童和青少年的惡性骨腫瘤，呈高度侵襲性［1］。目前主要采用多種抗腫瘤藥物聯合應用治療，然而抗腫瘤藥物特殊的毒副作用和耐藥性限制其廣泛應用。日前，許多學者已將研究方向轉向不良反應較小的生物治療。本試驗將INF-γ、DDP單用及聯用于體外培養的骨肉瘤細胞，觀察其對骨肉瘤細胞的誘導凋亡效應，為骨肉瘤的生物治療提供理論依據。通過觀察INF-γ與DDP聯合治療骨肉瘤的效應以篩選出敏感的聯合用藥方案，為骨肉瘤綜合治療提供新手段。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞培養 人骨肉瘤U-2OS細胞株(南京凱基生物科技有限公司)，10%小牛血清(杭州四季青公司)DMEM培養基，于37℃、5%CO2培養箱中培養。

1.1.2 主要試劑和儀器 重組人INF-γ(上海克隆高科技有限公司);順鉑(齊魯制藥有限公司);MTT(Sigma公司);酶聯免疫檢測儀(Thermo公司);流式細胞儀(Benckman公司)。

1.2 方法

1.2.1 MTT法 取對數生長期U-2OS細胞，4000細胞/孔接種于 96 孔板，24 h 后加 INF-γ(濃度 10、100、1000、10000 u/ml)和 DDP(濃度 5、10、15、20、25 μg/ml)，并設對照組。加藥48 h后每孔加MTT 20 ul，培養4 h后棄上清液，加150 ul DMSO，振蕩10 min，酶標儀測吸光度(A值)，測藥物單用及聯用對U-2OS細胞的抑制率，求半數抑制濃度(IC50值)。抑制率=(A對照組-A加藥組)/A對照組×100%。

聯合用藥效果判定:Q=E(A+B)/(EA+EB-EAxEB)，E(A+B)為兩藥合用抑制率，EA、EB為兩藥單用抑制率，Q＜0.85:兩藥作用拮抗，Q為0.85-1.15:兩藥作用相加，Q＞1.15:兩藥作用協同［2］。

1.2.2 流式細胞儀檢測藥物對細胞周期的影響 細胞培養結束，收集約(1～5)×106個/ml細胞，500～1000 rpm離心，棄培養液。3mL PBS洗滌。離心去除PBS，加預冷70%乙醇固定，4℃，1～2 h。離心棄固定液，3 ml PBS重懸。400目的篩網過濾1次，500～1000 rpm離心，棄去PBS。用1mL PI染液染色，4℃避光。FACScan流式細胞儀測定熒光強度，激發光波長為488nm，Cell-Quest分析軟件測定細胞周期。

2 結果

見圖1 ～2，表1、2、3。

圖1 不同濃度INF對U-20S細胞增殖抑制作用

圖2 不同濃度順鉑對U-20S細胞增殖抑制作用

表1 INF-γ聯合DDP同時給藥對U-2OS細胞增殖的抑制作用

表2 INF-γ聯合DDP序貫給藥對U-2OS細胞增殖的抑制情況

表3 INF-γ和DDP對人骨肉瘤U-2OS細胞周期的影響

3 討論

手術切除腫塊、新輔助化療等是治療骨肉瘤最常用的方法，但效果卻并不佳，40%患者在積極治療過程中腫塊復發或轉移。傳統治療方法不僅可能給患者帶來嚴重殘疾，而且毒副反應嚴重，腫瘤耐藥性的出現是繼續有效化療陷入困境。因此，尋找一種可有效殺傷腫瘤細胞，又不產生嚴重不良反應，且在治療過程中很少產生耐藥性的治療方案，是骨肉瘤治療研究的方向。研究表明順鉑、異環磷酰胺等單用對骨肉瘤的有效率達到26% ～80%，聯合應用有效率更高［3］。近年研究發現干擾素通過多種途徑直接發揮抗腫瘤作用，且可增強腫瘤對其他化療藥物的敏感性，減少毒副作用［4-8］。但INF-γ聯合DDP對骨肉瘤細胞增殖抑制作用的研究未見報道。

目前順鉑被證實能損傷腫瘤細胞DNA，引起DNA鏈間或鏈內交聯并誘導腫瘤細胞凋亡［9］。本研究證實DDP對人骨肉瘤U-2OS細胞生長有抑制作用，其生長抑制作用與DDP濃度呈正相關(見圖2)。DDP體外對U-2OS細胞增殖抑制作用的 IC50 約3.2 μg/ml。DDP 濃度自20 μg/ml起，其生長抑制作用進入平臺期。

干擾素抗腫瘤作用以INF-γ最強，其機理可能有:①抑制腫瘤細胞分裂:INF作用細胞膜，刺激腺苷酸環化酶，使cAMP增加，抑制DNA的合成及細胞分裂，故有抗腫瘤作用;②調動機體免疫系統，提高機體抗腫瘤免疫力:INF能增強巨噬細胞及NK細胞的殺傷性，增加細胞表面抗原和受體的表達，抑制B細胞的功能，從而降低腫瘤細胞表面封閉抗體的水平［10］。因此我們考慮可能 INF-γ(≥1000 u/ml)和 DDP共同作用于腫瘤細胞DNA，從而發揮相加作用抑制腫瘤細胞生長。本研究證實DDP以25 μg/ml單用于U-2OS細胞48 h，增殖抑制率是 78.1%，而 DDP以 5 μg/ml與 1000 u/ml INF-γ聯合作用48 h，增殖抑制率是81.6%(見表1)。此結果顯示，INF-γ(≥1000 u/ml)和DDP聯用可使順鉑在小劑量時即有明顯細胞增殖抑制作用，從而避免大劑量應用DDP引起的毒副作用。本實驗DDP作用24 h后再加INF-γ(≥1000 u/ml)作用24 h對U-2OS細胞的抑制率高于INF-γ作用24 h后再加DDP作用24h時的抑制率(見表2)，這為臨床用藥時間選擇提供了理論依據。

細胞持續增殖和細胞周期調節紊亂是腫瘤細胞的基本特征之一［11］。腫瘤細胞在生長過程中失去接觸抑制，周期檢控點功能喪失，無法調控抑制細胞進入S期，細胞持續分裂、不斷增殖，因此外源誘導物對細胞增殖的抑制作用，是判斷誘導物誘導分化能力的重要參考指標［12］。本研究表明，經過INF-γ、DDP單獨及聯合作用人骨肉瘤U-2OS細胞，細胞周期中G0/G1占整個細胞周期比例逐漸增高，而與細胞生長分裂關系較密切的S、G2/M期所占細胞周期比例則有明顯的降低，且聯合用藥降低的更明顯(見表5)。考慮INF-γ、DDP可能作為誘導物誘導人骨肉瘤U-2OS分化，抑制細胞分裂增殖。

通過對細胞周期的觀察以及在體外試驗單藥及聯合用藥情況，在不同藥物量效水平上定量分析各抗癌藥物之間的協同、相加和拮抗作用，可為骨肉瘤患者篩選出最敏感的聯合用藥方案，為臨床正確部署聯合化療方案提供可靠幫助。但INF-γ和順鉑聯合應用發揮細胞增殖抑制作用機制還有待于進一步研究。

［1］陳婧，劉云霞.骨肉瘤化療研究進展.浙江中西醫結合雜志，2010，1(20):53-55.

［2］熊化生，呂俊杰.姜黃素聯合順鉑對肺癌治療的體外實驗研究.實用臨床醫藥雜志，2007，11(3):62-64.

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［12］宋建曄，趙妍.維甲酸對人成骨肉瘤MG-63細胞增殖和相關基因表達的影響.現代生物醫學進展，2009，9(1):5-8.