接骨康合劑的質量標準研究

夏德豪，胡 劍

（湖南省邵陽市藥品檢驗所，湖南 邵陽 422001）

接骨康合劑為邵陽市中西醫結合醫院自制的醫院制劑，處方由大黃、青皮、當歸、紅花、地龍等10味藥材組成，具有行氣、行血、化瘀止痛、接骨續筋的功效，用于治療外傷淤血、扭傷、筋韌之傷、骨折初期等，經多年臨床驗證，療效確切。為了有效地控制制劑質量，本試驗采用薄層色譜（TLC）法對制劑中的大黃、青皮、當歸進行定性鑒別，采用高效液相色譜（HPLC）法對大黃中的大黃素進行含量測定，報道如下。

1 儀器與試藥

Waters高效液相色譜儀，包括1525泵、2996紫外檢測器、1500柱溫箱、717自動進樣器；AG-135型電子天平（梅特勒-托利多〈上海〉有限公司）。大黃素對照品（批號為110756-200512，供含量測定用）、大黃對照藥材（批號為120984-200602）、青皮對照藥材（批號為121155-200502）、當歸對照藥材（批號為120927-200613）均購自中國藥品生物制品檢定所；接骨康合劑（邵陽市中西醫結合醫院自制）；硅膠G（青島海洋化工廠）；甲醇為色譜純，水為重蒸餾水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 TLC鑒別

大黃：取樣品20 mL，用乙酸乙酯振搖提取3次，每次20 mL，合并乙酸乙酯液，將乙酸乙酯液蒸干，加水30 mL使溶解，用2%氫氧化鈉溶液振搖提取3次，每次20 mL，合并氫氧化鈉溶液，用濃鹽酸酸化后，用乙酸乙酯振搖提取3次，每次20 mL，合并乙醚液，乙醚液蒸干，殘渣加乙醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。取去大黃的其他處方量藥材，按制備工藝方法制成陰性樣品，取20 mL同法制成陰性對照品溶液。另取大黃對照藥材1 g，加甲醇10 mL，超聲處理20 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為對照藥材溶液。照TLC法[2005年版《中國藥典（一部）》附錄ⅥB]試驗，吸取上述3種溶液各10 μL，分別點于同一硅膠H薄層板上，以石油醚（30～60℃）-甲酸乙酯-甲酸（15∶4∶1）的上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，置碘蒸氣中薰約5 min，取出，待碘揮盡后，置可見光燈下檢視。結果供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應位置上顯相同顏色的斑點，陰性對照品溶液無干擾（圖1 A）。

青皮：取樣品20 mL，用乙酸乙酯20 mL振搖提取，乙酸乙酯提取液蒸干，殘渣加乙酸乙酯1 mL使溶解，作為供試品溶液。取去青皮的其他處方量藥材，按制備工藝方法制成陰性樣品，取20 mL同法制成陰性對照品溶液。另取青皮對照藥材1 g，加水50 mL煎煮20 min，濾過，濾液用乙酸乙酯20 mL同上法操作，作為對照藥材溶液。照TLC法[2005年版《中國藥典（一部）》附錄ⅥB]試驗，吸取上述3種溶液各10 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯（10∶6）為展開劑[1]，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰，置紫外光燈（365 nm）下檢視。結果供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應位置上顯相同顏色的熒光斑點，陰性對照品溶液無干擾（圖1 B）。

當歸：取樣品20 mL，用乙醚提取3次，每次20 mL，合并乙醚液，蒸干，殘渣加乙酸乙酯2 mL使溶解，作為供試品溶液。取去當歸的其他處方量藥材，按制備工藝方法制成陰性樣品，取20 mL同法制成陰性對照品溶液。另取當歸對照藥材1 g，加乙醚10 mL，超聲處理10 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加乙酸乙酯1 mL使溶解，作為對照藥材溶液。照TLC法[2005年版《中國藥典（一部）》附錄ⅥB]試驗，吸取上述3種溶液各10 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以環己烷-乙酸乙酯（4∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。結果供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應位置上顯相同顏色的熒光斑點，陰性對照品溶液無干擾（圖 1 C）。

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件

色譜柱：Kromasil C18柱 （250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇 -0.2% 磷酸（75 ∶25）[2]；檢測波長：254 nm；柱溫：35 ℃ ；流速：1.0 mL/min；進樣量：10 μL。

2.2.2 溶液制備

精密稱取大黃素對照品10.23 mg，置50 mL量瓶中，加甲醇適量使溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取20 mL，置100 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液（質量濃度為10.23 μg/mL）。精密吸取樣品10 mL，置具塞錐形瓶中，精密加入三氯甲烷50 mL和10%鹽酸溶液10 mL，密塞，稱定質量，加熱回流2 h，放冷，稱定質量，用三氯甲烷補足減失的質量，搖勻，分取三氯甲烷液，精密量取20 mL，減壓回收至干，殘渣加甲醇使溶解，轉移至10 mL量瓶中，并用甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得供試品溶液。取除大黃外的其他處方量藥材，按制備工藝方法制備陰性樣品，按供試品溶液制備方法制成陰性對照品溶液。

2.2.3 方法學考察

系統適用性試驗與陰性干擾試驗：分別精密吸取對照品溶液、陰性對照品溶液與供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，按擬訂的色譜條件測定。結果大黃素與其他組分色譜峰可達基線分離，且與相鄰色譜峰分離度大于1.5，理論塔板數按大黃素峰計均在3 000以上，表明色譜行為良好。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜峰相應的位置上檢出色譜峰，而陰性對照品溶液在與對照品溶液色譜峰相應的位置無色譜峰，說明陰性樣品對測定無干擾（見圖 2）。

線性關系考察：分別精密吸取質量濃度為10.23 μg/mL的大黃素對照品溶液 1，3，6，12，20，25 μL，注入液相色譜儀，按擬訂的色譜條件測定峰面積積分值，以對照品質量濃度為橫坐標、峰面積積分值為縱坐標繪制標準曲線，得回歸方程 A=2.43 × 106C+1 683.15，r=1.000 0（n=6）。結果表明大黃素進樣量在0.010 23～0.204 6 μg范圍內與峰面積積分值具有良好的線性關系。

精密度試驗：取同一質量濃度的大黃素對照品溶液，在擬訂的色譜條件下測定，連續進樣5次。結果峰面積積分平均值為235 128，RSD=1.67%（n=5）。表明方法精密度良好。

穩定性試驗:分別精密吸取同一供試品溶液10 μL，于0，2，4，8，16，24 h時進樣。結果大黃素峰面積積分平均值為231 287，RSD=0.63%（n=6）。表明供試品溶液在24 h內穩定。

重現性試驗：取同一樣品（批號為080901）5份，按擬訂的含量測定方法測定。結果大黃素平均含量為23.386 μg/mL，RSD=1.05%（n=5），表明方法重現性良好。

加樣回收試驗：分別精密量取對照品溶液（0.041 39 mg/mL）2.4，2.4，2.4，3.0，3.0，3.0，3.6，3.6，3.6 mL，置具塞錐形瓶中蒸干，各精密加入已知含量的供試品溶液5 mL（批號為080901，含量為23.386 μg/mL）和水5 mL，依法測定大黃素含量，計算回收率。結果見表1。

表1 大黃素加樣回收試驗結果（n=9）

2.2.4 樣品含量測定

分別取對照品溶液和供試品溶液各10 μL進樣，記錄色譜圖，按外標法計算大黃素含量。結果批號為080901，080902，080903的樣品中大黃素平均含量為 23.39，31.56，29.53 μg/mL（ n=3）。

3 討論

方中大黃為君藥，其主要有效成分為大黃素、大黃酸、大黃酚等蒽醌類化合物，而測定大黃素含量的HPLC法較成熟，故選擇大黃中的大黃素作為含量測定對象。

方中干擾成分多，而青皮TLC鑒別的顯色方法按文獻[2]在紫外光燈365 nm下檢視，只有1個斑點，且不清晰。試驗中改用10%硫酸乙醇溶液顯色，在105℃加熱后，置紫外光燈（365 nm）下檢視，專屬性斑點增加至3個，且斑點清晰，分離效果好。

本方法薄層色譜和含量測定的陰性均無干擾，制劑質量基本穩定，為制劑質量控制提供了有效的分析方法，且方法簡單，專屬性強、重現性好，精密度、回收率都較滿意，因此可作為接骨康合劑的質量控制方法。

[1]苗明三，李振國.現代實用中藥質量控制技術[M].北京：人民衛生出版社，2000：603.

[2]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）[M].北京：化學工業出版社，2005：17.