銅綠假單胞菌對(duì)喹諾酮類藥物耐藥作用的研究

葉曉林，王沼丹，楊曉波

（1.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，四川 成都 610044； 2.四川大學(xué)華西醫(yī)學(xué)中心，四川 成都 610044；3.四川省雙流縣中醫(yī)醫(yī)院，四川 成都 610044）

銅綠假單胞菌是重要的條件致病菌，臨床上大量抗菌藥物使用導(dǎo)致的耐藥性上升，使得治療銅綠假單胞菌感染十分困難。因此，對(duì)臨床分離的銅綠假單胞菌耐藥性進(jìn)行有效監(jiān)測(cè)，研究聯(lián)合用藥治療銅綠假單胞菌引起的疾病，對(duì)于合理選用最佳治療方案具有積極意義。氟喹諾酮類（fluoroquinolones，F(xiàn)QNs）抗菌藥物臨床用于治療多種細(xì)菌感染，包括呼吸道、泌尿道等感染，隨著其廣泛使用，耐藥性也越來越嚴(yán)重。主動(dòng)外排系統(tǒng)是導(dǎo)致銅綠假單胞菌耐藥的重要原因，其中銅綠假單胞菌MexAB-OprM外排系統(tǒng)是迄今最具有臨床意義的藥物外排系統(tǒng)[1-2]。筆者研究了臨床分離的銅綠假單胞菌對(duì)FQNs的耐藥性及其機(jī)制，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株來源：27株臨床分離的銅綠假單胞菌分別來自四川大學(xué)華西醫(yī)院傳染科，標(biāo)準(zhǔn)株ATCC27853由四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理教研室保存。

藥品及試劑：諾氟沙星（norfloxacin，NOR）、氧氟沙星（ofloxacin，OFL）、環(huán)丙沙星（ciprofloxacin，CIP）、左氧氟沙星（levofloxacin，LVX）、司帕沙星（sparfloxacin，SPLX），均由中國藥品生物制品檢定所提供。LB（Luria-Bertani）培養(yǎng)基，M-H肉湯培養(yǎng)基（浙江省軍區(qū)后勤部衛(wèi)生防疫檢驗(yàn)所），MH瓊脂平板。質(zhì)粒提取試劑盒，DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)物、Taq酶和dNTP，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）產(chǎn)物純化試劑盒、總RNA提取試劑盒，兩步法RT-PCR試劑盒，為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品。碳酰氰基-對(duì)-氯苯腙（CCCP）購自Sigma公司；其他試劑均為分析純（上海化學(xué)試劑廠）。

1.2 方法

最低抑菌濃度（MIC）的測(cè)定：用二倍稀釋法[3]測(cè)定 MIC。抗菌藥物的質(zhì)量濃度為 0.03，0.062，0.125，0.25 …… 64，128 mg/L，液體培養(yǎng)基中含菌量為1×105CFU/mL。MIC結(jié)果判斷參照National Committee for Clinical Laboratory Standards（NCCLS）公布的標(biāo)準(zhǔn)，銅綠假單胞菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC27853為質(zhì)控株。

CCCP對(duì) MIC的逆轉(zhuǎn)作用：在測(cè)定氟喹諾酮類藥物 MIC的同時(shí)，制備含有不同質(zhì)量濃度的喹諾酮類藥物和終質(zhì)量濃度為20mg/L CCCP的平板，測(cè)定CCCP是否對(duì)氟喹諾酮類藥物的體外抗菌活性有影響。若含CCCP的平板中測(cè)得的 MIC比單獨(dú)使用喹諾酮類藥物時(shí)相應(yīng)的 MIC降低4倍或以上，則表明有主動(dòng)外排機(jī)制的存在。

銅綠假單胞菌耐藥機(jī)制的研究：常規(guī)培養(yǎng)，離心收集菌體，提取銅綠假單胞菌染色體DNA、質(zhì)粒DNA以及細(xì)菌總RNA[4]。根據(jù)文獻(xiàn)提供的序列資料和方法，計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)擴(kuò)增銅綠假單胞菌oprM（GenBank accession number AE004676）和 mexR（GenBank accession number U23763）、qnr （GenBank accession number AY070235）基因的PCR引物[1]。mexR基因擴(kuò)增，以DNA為模板，產(chǎn)物預(yù)計(jì)為498 bp片段；條件為預(yù)變性94℃ 5 min，變性94℃ 1 min，退火54℃ 1 min，延伸72℃ 1 min，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)后再72℃ 延伸7 min。質(zhì)粒qnr擴(kuò)增，以質(zhì)粒DNA為模板，條件為預(yù)變性94℃ 5 min，變性94℃ 40 s，退火57℃ 40 s，延伸72℃ 40 s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)后再72℃ 延伸7 min，產(chǎn)物預(yù)計(jì)為338 bp片段。oprM基因擴(kuò)增，采用兩步法RTPCR擴(kuò)增檢測(cè)其表達(dá)情況，以總RNA為模板，首先反轉(zhuǎn)錄，然后進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，條件為預(yù)變性94℃ 5 min，變性94℃ 40 s，退火57℃ 40 s，延伸72℃ 40 s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)后再72℃ 延伸7 min，產(chǎn)物預(yù)計(jì)為244 bp片段。用凝膠回收試劑盒純化mexR基因擴(kuò)增產(chǎn)物，373A自動(dòng)測(cè)序儀（Applied Biosystems）進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)序。

2 結(jié)果

2.1 耐喹諾酮銅綠假單胞菌的藥物敏感試驗(yàn)

5種喹諾酮類藥物中沒有一種對(duì)27株銅綠假單胞菌敏感，且諾氟沙星、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、左氧氟沙星、司帕沙星的 MIC不小于64 μg/mL 的菌株數(shù)分別為 19，21，22，19，21 株，均出現(xiàn)了比較高的耐藥水平。MIC測(cè)定結(jié)果見表1。

表1 27株銅綠假單胞菌對(duì)氟喹諾酮類藥物的藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果[株（%）]

2.2 CCCP對(duì)MIC的逆轉(zhuǎn)作用

將27株耐藥株進(jìn)行CCCP逆轉(zhuǎn)作用試驗(yàn)，結(jié)果有3株耐諾氟沙星銅綠假單胞菌的 MIC能被CCCP逆轉(zhuǎn)，有4株耐環(huán)丙沙星銅綠假單胞菌的 MIC能被CCCP逆轉(zhuǎn)，有5株耐氧氟沙星銅綠假單胞菌的 MIC能被CCCP逆轉(zhuǎn)，有8株耐左氧氟沙星銅綠假單胞菌的 MIC能被CCCP逆轉(zhuǎn)，有4株耐司帕沙星銅綠假單胞菌的 MIC能被CCCP逆轉(zhuǎn)。結(jié)果見表2。

表2 CCCP對(duì)細(xì)菌耐藥的影響（MIC，mg/L）

2.3 銅綠假單胞菌MexAB-OprM外排系統(tǒng)oprM基因及其表達(dá)

oprM基因的RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果：對(duì)臨床分離的13號(hào)及25號(hào)銅綠假單胞菌喹諾酮耐藥株（主動(dòng)外排耐藥株）的oprM基因進(jìn)行了RT-PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果見圖1A。可見，13號(hào)及25號(hào)銅綠假單胞菌具有250 bp左右的條帶，標(biāo)準(zhǔn)敏感菌株擴(kuò)增產(chǎn)物量少，說明oprM基因的高表達(dá)與細(xì)菌的主動(dòng)外排多重耐藥有一定的關(guān)系。

MexAB-OprM系統(tǒng)的調(diào)節(jié)基因mexR基因測(cè)定：mexR基因表達(dá)結(jié)果見圖1B。可見，13號(hào)及25號(hào)銅綠假單胞菌具有500 bp左右的條帶。擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果表明，將mexR基因序列與gene bank中accession number U23763銅綠假單胞菌序列相比，25號(hào)耐藥株在編碼66位氨基酸處發(fā)生了堿基發(fā)生突變的情況（GCC→GTC，Ala→Val），但沒有檢測(cè)到堿基缺失，13號(hào)耐藥株則沒有發(fā)現(xiàn)堿基發(fā)生缺失和突變的情況。

質(zhì)粒qnr介導(dǎo)的銅綠假單胞菌耐藥分析：質(zhì)粒qnr基因經(jīng)PCR擴(kuò)增后，電泳無條帶顯示，說明在此次分離的耐藥菌株中沒有質(zhì)粒介導(dǎo)的耐藥產(chǎn)生。

3 討論

許多試驗(yàn)結(jié)果表明，銅綠假單胞菌臨床分離株對(duì)喹諾酮類藥物的耐藥性與喹諾酮類藥物在臨床上應(yīng)用的廣泛性一致，許多藥物呈高水平耐藥。此外，成都地區(qū)的銅綠假單胞菌對(duì)喹諾酮類藥物的耐藥情況與國內(nèi)其他地區(qū)有相似性。細(xì)菌對(duì)抗菌藥物的耐藥存在兩種重要的現(xiàn)象，即交叉耐藥和多重耐藥。本研究結(jié)果顯示，銅綠假單胞菌對(duì)5種喹諾酮藥物表現(xiàn)出交叉耐藥，而且均表現(xiàn)出高水平耐藥。這也是銅綠假單胞菌感染難治的重要原因之一。

許多研究表明，銅綠假單胞菌細(xì)胞膜上的多種蛋白具有將抗菌藥物主動(dòng)外排的作用，即細(xì)胞膜上存在主動(dòng)外排系統(tǒng)。CCCP是最典型的質(zhì)子泵抑制劑，可通過抑制主動(dòng)外排耐藥系統(tǒng)能量來源的質(zhì)子濃度梯度，從而破壞其主動(dòng)外排作用，表現(xiàn)為藥物在細(xì)菌中的蓄積顯著增加。本研究結(jié)果證實(shí)，銅綠假單胞菌對(duì)5種喹諾酮類藥物耐藥有主動(dòng)外排作用，而且主動(dòng)外排作用具有一定的特異性和交叉性；對(duì)氧氟沙星耐藥的13號(hào)和25號(hào)菌株細(xì)胞內(nèi)藥物蓄積量在加入CCCP后有所增加，說明了臨床分離銅綠假單胞菌主動(dòng)外排藥物的存在。因此，尋找能夠抑制細(xì)菌主動(dòng)外排作用的藥物，對(duì)于克服細(xì)菌耐藥具有重要意義。

主動(dòng)外排系統(tǒng)中，MexAB-OprM外排系統(tǒng)最具有臨床意義。OprM蛋白在MexAB-OprM外排系統(tǒng)中起著重要的作用，oprM基因過度表達(dá)，導(dǎo)致了銅綠假單胞菌對(duì)多種抗生素耐藥。本研究顯示，oprM基因在耐藥菌中過度表達(dá)，初步說明耐藥與oprM基因高水平表達(dá)具有相關(guān)性。MexR蛋白是MexAB-OprM外排系統(tǒng)生理?xiàng)l件下轉(zhuǎn)錄的阻遏蛋白，mexR基因的突變導(dǎo)致MexAB-OprM去阻遏，從而使細(xì)菌獲得耐藥性。對(duì)mexR基因的研究結(jié)果表明，存在堿基發(fā)生突變的情況，所翻譯的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化而失去阻遏蛋白的功能，進(jìn)而導(dǎo)致MexAB-OprM外排系統(tǒng)的過量表達(dá)，產(chǎn)生耐藥[5-6]。13號(hào)菌株沒有出現(xiàn)堿基發(fā)生缺失和突變的情況，說明MexAB-OprM外排系統(tǒng)的調(diào)控還有其他因素存在。

近年來許多學(xué)者發(fā)現(xiàn)，存在質(zhì)粒介導(dǎo)的耐藥機(jī)制，其中qnr質(zhì)粒編碼的qnr蛋白能阻斷喹諾酮類藥物對(duì)DNA回旋酶的抑制作用，從而引起低水平耐藥[7]。本研究中，沒有發(fā)現(xiàn)qnr質(zhì)粒介導(dǎo)的耐藥，這可能與檢測(cè)的菌株過少有一定的關(guān)系。

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