特發性肺纖維化病人肺成纖維細胞過度表達單核細胞趨化蛋白-1

鄧小玲 陳耿臻 許銘炎

特發性肺纖維化病人肺成纖維細胞過度表達單核細胞趨化蛋白-1

鄧小玲 陳耿臻 許銘炎

目的 研究凝血酶對正常人肺成纖維細胞(normal human lung fibroblasts,N-LF)和特發性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)病人肺成纖維細胞(F-LF)單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)表達的影響。方法 N-LF和F-LF細胞分別培養于96孔培養板內，凝血酶誘導4和24h后， 收集上清液并用ELISA方法檢測MCP-1蛋白水平。結果 凝血酶可誘導N-LF和F-LF細胞釋放MCP-1，但F-LF細胞的MCP-1分泌水平遠遠高于N-LF細胞。 結論 人肺成纖維細胞在肺纖維化過程中過度合成和釋放MCP-1，凝血酶可進一步促進其過度表達MCP-1。

凝血酶；單核細胞趨化蛋白-1；正常人肺成纖維細胞；肺纖維化病人肺成纖維細胞

肺纖維化是由于過多的成纖維細胞聚集和細胞外的基質成分如膠原蛋白沉積而導致正常的肺組織結構改變和功能喪失的一種疾病，是多種慢性肺疾病的常見結局，包括特發性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis, IPF)[1]。細胞因子如單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)在介導肺炎癥及纖維增生起關鍵作用：一方面通過募集和活化單核細胞，參與肺纖維化進程中的炎癥和纖維化應答；另一方面，通過促進成纖維細胞增生、分泌膠原及產生促纖維化細胞因子TGF-β參與胞外基質沉積及正常肺結構的改變[2-3]。

在急、慢性肺損傷的動物模型及肺纖維化病人的支氣管灌洗液中活性凝血酶的量顯著性增加，提示過度的凝血級聯反應可促進肺損傷及纖維化的病理生理進程[1-4]。凝血酶可誘導多種細胞分泌MCP-1，如上皮細胞[5]和人胚肺成纖維細胞[6]，但凝血酶是否可在肺纖維化時誘導MCP-1高表達還尚不清楚。本研究以正常人肺成纖維細胞(normal lung fibroblasts, N-LF)和IPF病人肺成纖維細胞(F-LF)為實驗對象，比較凝血酶對其MCP-1表達的調節作用。

1 材料與方法

1.1 材料 人凝血酶購于Sigma公司(美國)，DMEM培養液、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶消化液均購自于Gibco公司(美國)，人MCP-1 ELISA檢測試劑盒購于R&D公司(美國)，N-LF和F-LF均獲贈于英國諾丁漢大學肺呼吸研究中心。

1.2 方法

細胞培養 細胞接種于50mL培養瓶內，用DMEM完全培養液(含100mL/LFBS、100mg/L青/鏈霉素)，于37℃，50mL/LCO2培養箱中培養。等細胞鋪滿瓶底后，用2.5g/L胰蛋白酶-EDTA消化，將獲得的細胞分種于96孔培養板內，用100μL培養液培養24h后，換無血清培養液培養24h。實驗時，對照組內加入無血清的DMEM完全培養液，其它組每孔細胞內加入凝血酶(10nmol/L)，培養4和24h后收取細胞上清液并用人MCP-1 ELISA 檢測試劑盒檢測MCP-1水平(詳見說明書)。每組實驗均使用3孔細胞并重復3次。

2 結果

凝血酶誘導N-LF和F-LF細胞釋放MCP-1

結果顯示，凝血酶可顯著誘導N-LF和F-LF細胞呈時間相關性釋放MCP-1(P均＜0.05)，其中凝血酶刺激4和24h后N-LF細胞MCP-1的分泌水平分別是其相應對照組的2.6和69倍(圖1A)，而F-LF細胞MCP-1的分泌水平分別是其相應對照組的7和154倍(圖1B)。進一步比較兩組細胞MCP-1的分泌水平，結果顯示凝血酶刺激4和24 h后，F-LF細胞分泌的MCP-1均高于N-LF細胞(圖1C，P均＜0.05)。

3 討論

實驗證明敲除MCP-1或其主要受體CCR2均可保護由博萊霉素誘導的肺纖維化[7-8]。核酸原位雜交及免疫組化結果證實MCP-1在肺纖維化病人及博萊霉素誘導的肺纖維化鼠肺組織中過度表達[9-10]。臨床研究發現，血清中MCP-1分泌水平可作為生物標記用來衡量用皮質類固醇治療肺纖維化病人的治療效果[11]。因此，MCP-1在肺纖維化過程中炎癥修復及纖維增生中的作用日益得到關注和重視。

體內實驗結果發現敲除凝血酶受體后MCP-1的表達下調，而且凝血酶受體敲除可保護由博萊霉素誘導的肺纖維化，這間接說明MCP-1的高表達可加重肺纖維化[12]，但具體機制還不清楚。本實驗結果第一次報道了凝血酶可誘導原代培養的正常人肺成纖維細胞及IPF病人肺成纖維細胞釋放MCP-1。結果顯示在基礎條件下F-LF細胞MCP-1分泌水平高于N-LF，雖無統計學差異但說明在肺纖維化時成纖維細胞有過度釋放MCP-1的趨勢。本次實驗結果還顯示凝血酶均可誘導兩種細胞呈時間相關性釋放MCP-1，其中IPF病人肺成纖維細胞在所檢測的時間段釋放的MCP-1均遠遠高于正常人肺成纖維細胞，這說明在肺纖維化過程中凝血酶可誘導肺成纖維細胞過度釋放MCP-1。

圖1 凝血酶誘導N-LF和F-LF細胞釋放MCP-1

綜上所述，我們的結果表明在肺纖維化過程中，肺成纖維細胞有過度表達MCP-1的趨勢，凝血酶可持續高效地誘導肺成纖維細胞釋放MCP-1，但其具體機制還需進一步實驗證明。

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Objective To investigate the effects of thrombin on monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1)protein release and mRNA expression in both normal human lung fi broblasts (N-LF)and fi broblasts derived from IPF (idiopathic pulmonary fi brosis patient)(F-LF). Methods N-LF and F-LF were cultured in a 96-well culture plate. Cells were stimulated with thrombin (10 nmol/L)for 4 and 24 h. Culture supernatants from 96-well plates were collected and MCP-1 protein levels in supernatants were assessed by ELISA. Results Thrombin can induce N-LF and F-LF MCP-1 release, and the MCP-1 levels in F-LF are much higher than the MCP-1 levels in N-LF. Conclusion Fibroblasts MCP-1 mRNA derived from patients with IPF overexpress MCP-1 and thrombin can induce its MCP-1 expression with high eff i ciency.

Thrombin; Monocyte chemoattractant protein-1; Normal human lung fi broblasts; Fibrotic lung fi broblasts

10.3969/j.issn.1009-4393.2010.19.065

515041 汕頭大學醫學院細胞生物與遺傳教研室 (鄧小玲)汕大醫學院第二附屬醫院外科 (陳耿臻 許銘炎)