如何快速鑒定臨床標本中的糞腸球菌和屎腸球菌

黃蓉

腸球菌是醫院感染常見菌，其中糞腸球菌約占80%～90%，其次是屎腸球菌，約占50%～15%[1]。產β-內酰胺酶的腸球菌及耐高濃度氨基糖甙類腸球菌，特別是耐萬古霉素腸球菌的出現，給臨床治療帶來極大的困難[2]。此2種腸球菌的耐藥性差異性很大，快速準確地從臨床標本中區分、鑒定2種腸球菌已迫在眉睫。熒光原位雜交法采用標記不同熒光素的2條探針，可在2h內在一張玻片上同時快速鑒定糞腸球菌和屎腸球菌。

1 材料與方法

1.1 材料

1)標準參考菌株：所有標準菌株購自衛生部臨床檢驗中心，見表1。其中腸球菌11株，鏈球菌3株，葡萄球菌2株，微球菌1株。2)寡核甙酸探針：檢測糞腸球菌的ENF191探針5'端標記異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocy-anate, FITC)(綠色信號)，檢測屎腸球菌的ENU14探針5'端標記Cy3(紅色信號)，同時以通用探針EUB338和Non-EUB分別作陽性對照和陰性對照，探針由Euro Gentee BV(Maas-tricht，荷蘭)合成，探針的序列見表l。

1.2 方法

1)腸球菌的鑒定：常規培養后，用法國生物梅里埃AP120 STREP系統鑒定。2)熒光原位雜交法：取臨床標本涂片2張，一張用于革蘭染色，若發現短鏈狀排列的陽性球菌，將另一張先干燥固定，而后96%乙醇固定10min，空氣干燥；以2mg/mL的溶菌酶(Sigma)37℃下處理玻片15～30min，蒸餾水洗滌后干燥(溶菌酶溶于10mmol/LTris，pH8.0的緩沖液中)隨后將玻片置于70%的乙醇固定2min，空氣干燥；加入濃度為10ng/mL的混合探針，探針以10%福爾馬林雜交緩沖液稀釋(20mmol/LTris-HCI，0.9mol/LNaCl，0.1%SDS，pH7.2)，于50℃下雜交30min～1h；置玻片于洗滌緩沖液中(20mmol/LTris-HCI，180mmol/LNaCl，pH7.2)于50℃下洗滌10min，蒸餾水洗滌后空氣干燥；滴上1滴熒光媒介油，熒光顯微鏡下觀察。

1.3 數據分析

對每條探針而言，敏感性即雜交法檢出的靶細菌的陽性數占樣本中靶細菌數的百分比，特異性即雜交法檢出的靶細菌的陰性數占樣本中非靶細菌數的百分比，以傳統檢測方法的結果為金標準。

2 結果

2.1 雜交條件的優化

1)血培養標本溶菌酶37℃處理15min，其他標本溶菌酶37℃處理30min。2)血培養標本50℃下雜交30min，其他標本50℃下雜交1h即可見到較強的熒光信號。

2.2 探針的特異性評價

在本研究中，使用了糞腸球菌3株，屎腸球菌1株，其他腸球菌7株，葡萄球菌屬2株，鏈球菌屬3株，微球菌1株。對探針的特異性進行測試表明，ENF191探針和ENU140探針分別只與糞腸球菌和屎腸球菌發生特異性結合，與屬內其他腸球菌及形態相似的革蘭染色球菌均無交叉反應。

2.3 雜交法與培養法結果比較

在163例腸球菌陽性標本中，傳統法檢測出糞腸球菌145株，屎腸球菌12株，其他腸球菌6株；雜交法中ENF191探針檢測出糞腸球菌145株，ENU140探針屎腸球菌12株，其他6株腸球菌2條探針均未能檢出，結果見表2。

表1 探針序列

表2 雜交法檢測163例腸球菌臨床標本結果評價

3 討論

糞腸球菌和屎腸球菌是腸球菌中最常見的2種菌，可引起傷口、尿道感染及心內膜炎。在微生物實驗室，快速、特異、準確地檢測、鑒定病原菌，可有效地指導臨床使用抗生素[3-4]。通常以自動化儀器或商品化試劑盒鑒定腸球菌，但有時結果并不可靠。如屎腸球菌可誤鑒定為耐久腸球菌或海氏腸球菌。

16S rRNA基因序列分析最大的優勢是檢測速度快，常規的細菌培養方法無法與其相比。目前常將16S rRNA基因序列分析與形態學方法相結合，對細菌進行系統分類，用于臨床常規的檢測、鑒定[5]。

通過標準菌株對2條探針進行測試，顯示出了很好的特異性，對163例腸球菌陽性標本進行2種方法比較，也證實了2條探針的高度特異性和敏感性，這與探針的設計和雜交條件的選擇有關。實驗中發現，10%福爾馬林可保持雜交的嚴謹性。血培養與其他標本相比，預雜交和雜交時間均短，可能與血培養物為快速生長的細菌、細胞壁的通透性好有關。

在送檢前使用過抗生素的標本中，可出現革蘭染色陽性。但培養陰性的情況，雜交法不受此因素影響。在各類臨床標本中，陽性血培養標本可直接鑒定，膿液、傷口分泌物也無需培養直接鑒定，尿液標本先離心后也可直接鑒定，但腦脊液、胸腹水等含菌量少的標本，受熒光原位雜交(fluorescence in situ hy-bridization, FISH)檢測限103CFU/mL的影響[3]，需經培養后才可運用雜交法鑒定。

[1]李金鐘.腸球菌分類與鑒定新進展[J].臨床檢驗雜志,2006,24(3):228-230.

[2]王斌,朱旭慧,張蓓等.654株腸球菌的耐藥性分析[J].國際檢驗醫雜志,2006,27(3):285-286.

[3]王沛，Welling GW,Meesen N,等.熒光原位雜交法快速鑒定金黃色葡萄球菌和凝固酶陰性葡萄球菌[J].中華檢驗醫學雜志,2004,21(2):434-436.

[4]Wellinghausen N,Bartel M,Essig A,et al.Rapid identification of clinically relevant enterococcus species by floresence in situ by-bridization[J].J Clin Microbiol,2007,45(10):3424-3426.

[5]李霞,高謙.16SrRNA基因序列分析在臨床微生物中的應用[J].微生物與感染,2006,1(3):184-186.