松針揮發(fā)油對烏頭堿誘發(fā)大鼠心律失常的影響*

黃雪泉

(廣西柳州畜牧獸醫(yī)學(xué)校,廣西柳州 545003)

松針揮發(fā)油對烏頭堿誘發(fā)大鼠心律失常的影響*

黃雪泉

(廣西柳州畜牧獸醫(yī)學(xué)校,廣西柳州 545003)

為了測定松針揮發(fā)油對烏頭堿誘發(fā)大鼠心律失常的影響,采用靜脈注射烏頭堿復(fù)制大鼠心律失常的動物模型,觀察灌胃給藥松針揮發(fā)油對抗烏頭堿誘發(fā)大鼠心律失常的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn),松針揮發(fā)油的低、中、高劑量可顯著延遲VP(室性早博)和VT(室性心動過速)的出現(xiàn)(與陰性對照組對比P＜0.01、P＜0.05),而以中劑量效果最好(與陰性對照組對比P＜0.01)。陽性對照組普羅帕酮對VT(室性心動過速)和VF(心室纖顫)的出現(xiàn)具顯著延遲作用(與陰性對照組對比P＜0.01),但對VP的出現(xiàn)與陰性對照組相比卻無顯著差別(P＞0.05)。說明松針揮發(fā)油對藥物誘發(fā)的心律失常具對抗作用。

松針揮發(fā)油;烏頭堿;大鼠;心律失常

松針(Pine needles)為松科(Pinaceae)松屬(Pinus)植物的針葉,其來源主要有黑松、油松、紅松、西伯利亞紅松、云南松和馬尾松 (Pinus massonianaLams)等[1]。全世界有一百多種松,在廣西分布的主要為云南松和馬尾松。松香、松實(shí)、松針歷代均入藥用。目前國內(nèi)外對松針的研究和利用重點(diǎn)均放在松針提取物營養(yǎng)方面[2-4],對松針揮發(fā)油藥理作用研究較少。本試驗(yàn)測定松針揮發(fā)油對SD大鼠烏頭堿誘發(fā)大鼠心律失常的影響,觀察微觀藥用效果,旨在為研究開發(fā)松針揮發(fā)油產(chǎn)品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品及試劑 松針揮發(fā)油藥液配制:量取8.58、2.71、0.86 mL揮發(fā)油,分別以50 mL/L吐溫-80生理鹽水配為120 mL溶液,即得松針揮發(fā)油的高、中、低給藥濃度,配好的藥液裝瓶蓋緊置4℃冰箱存放,每天灌胃前2 h將藥取出,使藥液溫度和室溫平衡。烏頭堿來自中國藥品和生物制品檢定所標(biāo)準(zhǔn)對照品(批號 061012),用生理鹽水配成濃度12 mg/L;戊巴比妥鈉,廣東佛山市化工實(shí)驗(yàn)廠生產(chǎn)(批號060901);普羅帕酮,上海醫(yī)藥(集團(tuán))有限公司信誼制藥總廠生產(chǎn)(批號070302);聚山梨酯-80(吐溫-80)上海申宇醫(yī)藥化工有限公司生產(chǎn)(批號080434);生理鹽水由柳州畜牧獸醫(yī)學(xué)校動物生產(chǎn)實(shí)驗(yàn)室配制。

1.1.2 儀器 RM6240C型多道生理記錄處理系統(tǒng)為成都儀器廠生產(chǎn)。動物人工呼吸機(jī)為上海奧爾科特生物科技有限公司生產(chǎn)。銀球懸浮電極為成都儀器廠生產(chǎn)。針型電極為江蘇科倫醫(yī)療器械有限公司生產(chǎn)。注射器為廣東龍心醫(yī)療器械有限公司生產(chǎn)。玻璃勾,柳州畜牧獸醫(yī)學(xué)校動物生產(chǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動物 230 g±20 g SD大鼠35只,雌雄各半,從廣西柳州醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校實(shí)驗(yàn)動物中心購進(jìn)(使用合格證:桂實(shí)動管使第12號)。大鼠進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室后適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d,室溫25℃±3℃,濕度70%左右。全價顆粒飼料由廣西柳州醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校實(shí)驗(yàn)動物中心提供。

1.2 方法

1.2.1 提取馬尾松松針揮發(fā)油 參照文獻(xiàn)[5],將1 000 g馬尾松新鮮針葉全剪為3.5 cm長的規(guī)格,置入6.5 L的家用高壓鍋內(nèi),加自來水2 000 mL,攪拌后蓋好。鍋置1 000 W的電爐上,再用乳膠管連接高壓鍋的出氣管口,乳膠管另一端連接測定器的分叉管口;將測定器套緊回流冷凝管,然后安裝其余部件。整個裝置裝好后,檢查確保牢穩(wěn)、密閉。開始加熱,有水蒸氣進(jìn)入乳膠管中時開冷凝水,進(jìn)行蒸餾提取。將所得揮發(fā)油裝棕色瓶密封后置-20℃冰箱內(nèi)[6]。全部藥液用121℃高壓滅菌 15 min～20 min,取出后置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 試驗(yàn)分組及給藥 雄性SD大鼠35只,隨機(jī)分為5組,每組7只,即陰性對照組、陽性對照組(普羅帕酮組)[7]、松針揮發(fā)油低劑量組(簡稱揮發(fā)油低)、松針揮發(fā)油中劑量組(簡稱揮發(fā)油中)、松針揮發(fā)油高劑量組(簡稱揮發(fā)油高)。以文獻(xiàn)記載的其揮發(fā)性成分小鼠口服(Per ora,PO)的LD50＞18 g/kg來折算小鼠灌胃給藥劑量[8],按表1所示劑量灌胃給藥。大鼠普羅帕酮的的灌胃用量根據(jù)人用等效劑量。陰性對照組與試驗(yàn)組對應(yīng),給予等容量50 mL/L吐溫-80生理鹽水。每日9:00灌胃,1次/日。第5天21:00禁食,第6天給藥后1 h,腹腔注射10 mL/L戊巴比妥鈉40 mg/kg麻醉,仰臥位固定。將12 mg/L烏頭堿以30 μg/kg大鼠舌下靜脈注射給藥,1 min給完[9]。以針型電極插入三肢皮下并連續(xù)記錄標(biāo)準(zhǔn)肢體Ⅱ?qū)?lián)心電圖(ECG);持續(xù)記錄ECG,待典型的頻發(fā)室性早搏(VP)出現(xiàn)后,表示造模成功。分別記錄出現(xiàn)VP(室性早博)、VT(室性心動過速)及VF(心室纖顫)的時間,以對比各組的差異。

1.2.3 統(tǒng)計 采用SPSS11.0統(tǒng)計軟件的Independent-samples T-test,分別檢驗(yàn)各治療組、陽性對照組與陰性對照組的各計量指標(biāo)的差別;計數(shù)指標(biāo)采用卡方檢驗(yàn),以比較各組之間的差別。

2 結(jié)果

2.1 對大鼠心律失常的影響

在對烏頭堿誘發(fā)大鼠心律失常的出現(xiàn)時間方面,松針揮發(fā)油的低、中、高劑量可顯著延遲VP和VT的出現(xiàn)(與陰性對照組對比P＜0.01、P＜0.05),而以中劑量效果最好(與陰性對照組對比P＜0.01)。陽性對照組普羅帕酮對VT(室性心動過速)和VF(心室纖顫)的出現(xiàn)具顯著延遲作用(與陰性對照組對比P＜0.01),但對VP的出現(xiàn)與陰性對照組相比卻無顯著差別(P＞0.05)。揮發(fā)油低和高劑量能減少大鼠的死亡率,對烏頭堿中毒大鼠具有顯著的保護(hù)作用(與陰性對照組對比P＜0.05、P＜0.01)(表1)。

表1 松針揮發(fā)油不同劑量對烏頭堿誘發(fā)大鼠心律失常的影響Table 1 The effect of pine needle volatile oil of different doses on the aconitine-induced arrhythmia in rats

2.2 大鼠死亡率的變化

所有造摸大鼠在靜脈注射烏頭堿后于2.5 min內(nèi)ECG顯示出現(xiàn)心律失常,陰性對照組7只迅速發(fā)生多種心律失常:頻發(fā)室早、室速、竇性心動過緩、室性加速性節(jié)律、室顫、心臟停搏,并相繼于11.25、11.75、11.90 、12.20 、12.90、13.25 、13.83 min 死亡,平均死亡時間為(12.00±2.58)min;揮發(fā)油低劑量組大鼠在靜脈注射烏頭堿后,2只于觀察時間28 min后,仍為室速,分別于29.10、31.50 min死亡;另 4只分別于 35.00、38.50、39.33、41.15 min 恢復(fù)竇律。揮發(fā)油中劑量組大鼠在靜脈注射烏頭堿后,4只于觀察時間 25 min后,仍為室速,分別于 29.35、32.50、33.15、38.75 min 死亡;;另 3 只分別于35.00、37.00、39.75 min恢復(fù)竇律。揮發(fā)油高劑量組大鼠在靜脈注射烏頭堿后,1只于觀察時間28 min后,仍為室速,于40.75 min死亡;;另6只分別于31.10 、32.35 、32.90 、33.50 、35.75 、36.00 、36.75 min恢復(fù)竇律。普羅帕酮組大鼠在靜脈注射烏頭堿后,4只于觀察時間 29 min后,仍為室速,分別于 33.35、35.70、38.15、45.75 min死亡 ;另3 只分別于30.70、31.45和33.35 min恢復(fù)竇律。

3 討論

松針揮發(fā)油的灌胃劑量,預(yù)試驗(yàn)時以文獻(xiàn)記載的其揮發(fā)性成分小鼠PO LD50＞18 g/kg來折算小鼠灌胃給藥劑量:即高劑量為6.39 mL/kg小鼠;中劑量為2.02 mL/kg小鼠;低劑量為0.64 mL/kg小鼠[8]。折算出正式試驗(yàn)大鼠灌胃給藥劑量:高劑量為0.715 mL/kg、中劑量為0.226 mL/kg、低劑量為0.072 mL/kg。

吐溫-80是一種乳化劑也是揮發(fā)油的助溶劑。試驗(yàn)初以10 mL/L的吐溫-80生理鹽水液溶解松針揮發(fā)油,發(fā)現(xiàn)靜置片刻即分層,故改用50 mL/L的吐溫-80生理鹽水液溶解,揮發(fā)油較易溶且不分層。

研究揮發(fā)油的藥理作用一般有兩種給藥方式,即灌胃和腹腔注射法。潘炘等[10]將偃松葉揮發(fā)油腹膜腔注射(peritoneal injection,in)給藥,對大鼠呈現(xiàn)出顯著的解熱和抗炎活性,灌胃給藥抗炎作用依然存在。本試驗(yàn)考慮到如松針揮發(fā)油開發(fā)成新藥也可以口服給藥,故試驗(yàn)中均采用動物灌胃給藥。

研究抗心律失常藥,需要心律失常動物模型[11]。引起試驗(yàn)性心律失常方法較多,如藥物誘導(dǎo)心律失常法、電刺激引起心律失常法、結(jié)扎冠狀動脈引起心律失常法等。但目前尚無理想的心律失常動物模型,因此,需要幾種模型相互配合來分析抗心律失常藥的作用機(jī)理[12-15]。考慮本試驗(yàn)研究的目的和實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有條件等因素,本文采用了烏頭堿誘導(dǎo)大鼠室性心律失常模型,通過肢體標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ?qū)?lián)記錄心電圖來觀察心律失常發(fā)生、持續(xù)時間和心律失常類型等。

松針揮發(fā)油的低、中、高三個劑量均可延緩烏頭堿致大鼠VT的出現(xiàn),而以中劑量(0.226 mL/kg)效果最好(與陰性對照組比P＜0.01;另兩組則P＜0.05)。在延緩VF出現(xiàn)方面,則只有中劑量和高劑量組能取得效果(兩組與陰性對照組比均為P＜0.01),這提示對抗VF的出現(xiàn)所需的揮發(fā)油劑量比對抗VT所需的劑量要高。松針揮發(fā)油低劑量(0.072 mL/kg)和高劑量組(0.715 mL/kg)能顯著降低烏頭堿致大鼠的死亡率(與陰性對照組比P＜0.05和P＜0.01)。雖然此試驗(yàn)中該作用未能取得劑量依賴性結(jié)果(中劑組未顯效),但提示與普羅帕酮(與陰性對照組比P＞0.05)對比松針揮發(fā)油對烏頭堿致大鼠中毒具明顯的保護(hù)作用,將來可以對此作用進(jìn)行進(jìn)一步研究。

本試驗(yàn)中的烏頭堿法以測定小鼠ECG來判斷是否發(fā)生室顫,這與傳統(tǒng)以開胸通過肉眼判斷室顫發(fā)生情況相比,具有更客觀、效率更高,便于試驗(yàn)結(jié)果的分析和保存,具有說服力。該方法以大鼠為試驗(yàn)動物,試驗(yàn)周期短,操作簡便,費(fèi)用較低,是篩選抗心律失常藥的好方法。動物藥物試驗(yàn)的動物樣本,數(shù)量越大試驗(yàn)統(tǒng)計越好,用t檢驗(yàn)則要求樣本呈正態(tài)分布;非正態(tài)則要求試驗(yàn)組樣本大于60個就可以當(dāng)成近似正態(tài)分布。用秩和檢驗(yàn),則對標(biāo)本的分布沒有要求,大中型動物一般最少每組6只～8只;小型動物8只～10只。由于條件限制本試驗(yàn)每組樣本設(shè)為7只;將來的試驗(yàn)可以擴(kuò)大樣本數(shù)量,更利于數(shù)據(jù)統(tǒng)計。

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Pharmncological Effect of Pine Needle Volatile Oil on Aconitine-induced Arrhythmia in Rats

H UANG Xue-quan

(School of Liuzhou Animal Husbandry and Veterinary Medicine,Liuzhou,Guangxi,545003,China)

To determine the effect of pine needle volatile oil on the aconitine-induced arrhythmia,aconitine was intravenously injected in rats,and then poured pine needle volatile oil into their stomachs,so as to observe the effect of pine needle volatile oil against aconitine-induced arrhythmia.The results showed that pine needle volatile oil of low,medium and high doses could significantly delay the emergence of VP(ventricular premature beats)and VT(ventricular tachycardia)(compared with the negative control group:P＜0.01,P＜0.05),and the medium doses had the best result(compared with the negative control group,P＜0.01).Among the positive control group,propafenone could significantly delay the emergence of VT(ventricular tachycardia)and VF(ventricular fibrillation)(compared with the negative control group,P＜0.01).However,there was no significant difference between the positive control group and the negative control group in preventing the emergence of the VP(P＞0.05).T hese reveaed that pine needle volatile oil is resistant to drug-induced arrhythmia.

pine needle volatile oil;aconitine;rat;arrhythmia

S859.79;S852.166

A

1007-5038(2010)09-0068-04

2010-03-07

黃雪泉(1969-),男(壯族),廣西田東人,實(shí)驗(yàn)師,主要從事實(shí)驗(yàn)教學(xué)和養(yǎng)殖技術(shù)推廣工作。