治療奶牛乳腺炎蒙藥復(fù)方提取物抗大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌作用研究*

包金榮,王純潔,戰(zhàn)永波,敖日格樂,吳海燕

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)與醫(yī)學(xué)學(xué)院,內(nèi)蒙古呼和浩特 010018)

治療奶牛乳腺炎蒙藥復(fù)方提取物
抗大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌作用研究*

包金榮,王純潔*,戰(zhàn)永波,敖日格樂,吳海燕

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)與醫(yī)學(xué)學(xué)院,內(nèi)蒙古呼和浩特 010018)

對兩種蒙藥復(fù)方進(jìn)行乙醇回流提取,然后分別用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取,得到石油醚層浸膏、乙酸乙酯層浸膏、正丁醇層浸膏和水母液浸膏,并分別對各種提取物進(jìn)行奶牛乳腺炎兩種主要致病菌大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌的體外抑菌和體內(nèi)抗菌作用,用牛津杯法測定提取物對大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌抑菌圈直徑,用二倍稀釋法測定了其在體外的最低抑菌濃度(MIC)和最低殺菌濃度(MBC)。又以兩種致病菌的混合菌感染小鼠,灌服蒙藥復(fù)方提取物以測定其體內(nèi)抗菌效果。結(jié)果表明,兩種蒙藥復(fù)方的體外抑菌成分主要集中在乙酸乙酯層浸膏和正丁醇層浸膏內(nèi),抑菌環(huán)直徑均大于16.88 mm,最大達(dá)到21.61 mm;對兩種致病菌的MIC和MBC最低可達(dá)到0.031 5 g/mL和0.062 5 g/mL;兩種蒙藥復(fù)方提取物的體內(nèi)抗菌成分重要集中在石油醚層浸膏和水母液浸膏內(nèi),對小鼠死亡保護(hù)率明顯高于陰性對照組,可達(dá)87.5%。

蒙藥;抑菌;小鼠;存活率

*通訊作者

奶牛乳房炎主要由金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌和鏈球菌等致病菌引起[1-2],是導(dǎo)致奶牛業(yè)經(jīng)濟(jì)損失最嚴(yán)重的疾病[3-4]。傳統(tǒng)奶牛乳腺炎治療方法多采用抗生素,但隨著耐藥菌株的不斷增多和耐藥性的不斷變化[5-6],食品中抗生素的殘留問題日益受到人們的關(guān)注[7],迫切需要一種安全、綠色的奶牛乳腺炎治療方法。蒙藥是純天然藥物,含有多種生物有效成分[8]。本研究旨在對已研發(fā)出的治療奶牛乳房炎的兩種蒙藥復(fù)方的活性部位進(jìn)行初步定位,對奶牛場乳房炎奶樣中分離出的大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌進(jìn)行體外抑菌和體內(nèi)抗菌試驗,為該蒙藥復(fù)方的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ),也為研發(fā)治療奶牛乳房炎的蒙藥制劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑及藥物 普通瓊脂、伊紅美藍(lán)瓊脂、血瓊脂培養(yǎng)基,普通肉湯,均按常規(guī)方法配制;蒙藥購自呼和浩特九合永齡堂。方Ⅰ:訶子70 g,大黃70 g,連翹 35 g,蒲公英70 g,乳香 30 g,沒藥30 g,牛蒡子30 g等七味蒙藥復(fù)方(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生理實驗室結(jié)合正交設(shè)計和蒙醫(yī)藥理論研制,以下簡稱正交復(fù)方);方 Ⅱ:訶子50 g,黃柏 50 g,梔子50 g,大黃50 g,胡黃連50 g,姜黃 50 g,川楝子 50 g等七味蒙藥(傳統(tǒng)蒙醫(yī)藥復(fù)方,以下簡稱傳統(tǒng)復(fù)方),蒙藥單藥購于呼和浩特九合永齡堂。

1.1.2 實驗動物 100只昆明系小鼠,雌雄各半,體重20 g±2 g,購于內(nèi)蒙古大學(xué)實驗動物中心。

1.1.3 菌種 由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生理實驗室在呼和浩特地區(qū)牛場乳腺炎奶樣分離出金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌。

1.2 方法

1.2.1 抑菌直徑測定 兩種干燥蒙藥復(fù)方各5 kg,粉碎。每次取200 g復(fù)方加入2 000 mL的三頸燒瓶中,加入 800 mL工業(yè)酒精,用水浴鍋加熱至回流,分別提取3次,每次提取1.5 h。過濾,合并提取液,減壓濃縮提取液,回收酒精后,蒙藥方Ⅰ、Ⅱ分別得到1 600 g和1 250 g的含水初浸膏。將兩種蒙藥復(fù)方含水初浸膏分別分散于適量水中,依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取,回收溶劑,蒙藥復(fù)方Ⅰ得到石油醚層浸膏56 g,乙酸乙酯層浸膏180 g,正丁醇層浸膏230 g,水母液浸膏。蒙藥復(fù)方Ⅱ得到石油醚層浸膏36 g,乙酸乙酯層浸膏165 g,正丁醇層浸膏200 g。將各提取物分散在水中,制成0.1 g/mL藥液,采用牛津杯法,加入100 μL藥液于制備的帶有菌層的平皿中,蓋好,37℃培養(yǎng)24 h,測量抑菌圈直徑,大于 15 mm為極度敏感;大于10 mm小于15 mm為高度極敏;大于8 mm小于10 mm為敏感;小于8 mm為不敏感[9]。

1.2.2 MIC和MBC的測定 以營養(yǎng)肉湯2倍稀釋 4 種方藥,使藥液濃度為 1.0 、0.5、0.25 、0.125、0.062 5、0.031 25 g/mL各試管中分別加入上述制備的菌液50 μL,搖勻,37℃培養(yǎng)24 h,以不顯示濁度細(xì)菌為生長時藥物濃度作為MIC。再從未見細(xì)菌生長的各試管培養(yǎng)物中分別吸取50 μL,接種于平皿瓊脂培養(yǎng)基上,37℃培養(yǎng)24 h。生長的菌落數(shù)小于5個菌落的藥液濃度,即為最低殺菌濃度(MBC)[10]。

1.2.3 體內(nèi)抑菌試驗 試驗小鼠隨機(jī)分成10組,每組10只,陽性對照組,陰性對照組,正交復(fù)方水母液組、乙酸乙酯萃取物組、正丁醇萃取物組、石油醚萃取物組及傳統(tǒng)復(fù)方水母液組、乙酸乙酯萃取物組、正丁醇萃取物組、石油醚萃取物組等。陽性對照組灌服0.6%環(huán)丙沙星藥液0.13 g/kg;陰性對照組灌服滅菌自來水20 g/kg,其他各組分別灌胃2 g/kg。各組小鼠在感染菌液之前每天灌胃2次,連續(xù)7 d,末次給藥1 h后給每只小鼠腹腔注射80%最低致死量(MLD)混合致病菌,觀察感染后2 d內(nèi)各組小鼠的死亡情況,計算保護(hù)率,保護(hù)率=(陰性對照組死亡數(shù)-處理組死亡數(shù))/陰性對照動物死亡數(shù)×100%。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 采用SAS8.0軟件進(jìn)行方差分析,用±S的方式表示。

2 結(jié)果

2.1 蒙藥復(fù)方提取物體外抑菌直徑

除石油醚萃取物外,致病菌對其他兩種蒙藥復(fù)方的提取物均達(dá)到高度敏感,其中對正丁醇萃取物和乙酸乙酯萃取物達(dá)到極度敏感;對正交復(fù)方石油醚萃取物不敏感,對傳統(tǒng)復(fù)方石油醚萃取物敏感;并且乙酸乙酯和正丁醇萃取物對致病菌的體外抑菌直徑均顯著高于水母液,極顯著高于石油醚萃取物(表1)。

表1 蒙藥復(fù)方提取物體外抑菌直徑Table 1 T he bacteriostasis diameter of the Mongolian compound ex tracts

2.2 蒙藥復(fù)方提取物的MIC和MBC

兩種蒙藥復(fù)方的正丁醇萃取物和乙酸乙酯萃取物對兩種致病菌均有顯著抑菌效果,MIC和MBC分別達(dá)到 0.031 25 g/mL、0.062 5 g/mL和0.062 5 g/mL、0.125g/mL;水 母 液次 之為0.125 g/mL和0.25 g/mL,而石油醚萃取物基本無體外抑菌效果(表2)。

2.3 體內(nèi)抗菌試驗

由表3可知,試驗組對小鼠死亡保護(hù)率均顯著高于陰性對照組(P＜0.05),其中兩種蒙藥復(fù)方的水母液對小鼠的保護(hù)率為75%,與陽性對照組相當(dāng),傳統(tǒng)蒙藥復(fù)方的石油醚萃取物對混合菌感染小鼠的保護(hù)率高達(dá)87.5%,高于陽性對照組。

表2 蒙藥復(fù)方提取物體外MIC和MBCTable 2 MIC and MBC of the Mongolian compound ex tracts in vitro

表3 蒙藥復(fù)方提取物對混合菌液感染小鼠的保護(hù)率測定結(jié)果Table 3 Determination of protection rate of mice infected by mixed bacteria suspension

3 討論

蒙藥是純天然的綠色藥物,含有多種抑菌藥物,從而為新型治療奶牛乳房炎藥物的研發(fā)提供了保證[11]。蒙藥復(fù)方提取物體外抑菌試驗表明,這兩種蒙藥復(fù)方的體外抑菌有效成分主要集中在乙酸乙酯和正丁醇萃取物中,水母液略有抑菌作用,而石油醚萃取物基本無體外抑菌效果。蒙藥復(fù)方提取物的體內(nèi)抗菌試驗表明,蒙藥復(fù)方體內(nèi)活性成分主要集中在水母液和石油醚萃取物中,乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物的活性較小。

長期以來,人們在研發(fā)抗菌消炎藥物時,對藥物的體外抑菌效果非常重視,甚至作為主要參考指標(biāo),但本研究表明這兩種蒙藥復(fù)方提取物的體外抑菌效果與體內(nèi)抗菌效果并不一致,這可能與藥物體內(nèi)代謝轉(zhuǎn)化,以及抗炎、免疫增強(qiáng)等作用有關(guān)[12],其具體機(jī)理有待于進(jìn)一步研究。

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Effect of Compound Mongolian Medicine Extract Curing Cow Mastitis on Anti-Escherichia coliandStaphylococcus aureus

BAO Jin-rong,WANG Chun-jie,ZHAN Yong-bo,AO Ri-ge-le,WU Hai-yan

(College of Animal Science and Veterinary Medicine,Inner Mongolia Agriculture University,Huhhot,Inner Mongolia,010018,China)

T o study the antibacterial effect of compound Mongolian medicine extract on two main pathogenic bacteria,Staphy lococcus aureusandEscherichia coliof cow mastitis,in vitroandin vivo,the bacteriostasis circle diameters of the exstracts were determined by Oxford cup law,the minimal inhibitory concentration(MIC)and minimal bactericidal concentration(MBC)of compound Mongolian medicine extracts were examinedin vitroby two times dilution method.Besides,the antibacterial effect of Mongolian medicine extracts on the mice infected withStaphylococcus aureusandEscherichia colimixed suspension was observed.The results showed that two extracts had significant inhibiting effect on the two kinds of bacteria;bacteriostasis circle diameter were more than 16.88 mm,up to 21.61 mm mostly.The strongest inhibitory action of compound extracts in MIC and MBC were 0.031 5 g/mL and 0.062 5 g/mL,respectively.The survival rate of infected mice were higher than that of negative control after taking the compound extracts orally,the highest of which was 87.5%.

Mongolian medicine;anti-bacterium;mouse;survival rate

S859.3

A

1007-5038(2010)09-0055-04

2009-12-29

內(nèi)蒙古自然科學(xué)基金重點項目(200607010403);教育部春暉計劃啟動資金;內(nèi)蒙古教育廳高校項目(NJZY07042)

包金榮(1985-),女(蒙古族),內(nèi)蒙古通遼人,碩士研究生,主要從事動物免疫生理學(xué)研究。