高鉬低銅對小鼠腎臟結構及其表達TNF-α蛋白的影響*

王宏偉,周變華,張 樑,張 森,胡文發,楊自軍

(河南科技大學動物科技學院,河南洛陽 471003)

高鉬低銅對小鼠腎臟結構及其表達TNF-α蛋白的影響*

王宏偉,周變華,張 樑,張 森,胡文發,楊自軍

(河南科技大學動物科技學院,河南洛陽 471003)

為研究高鉬低銅對小鼠腎臟結構及TNF-α蛋白表達的影響,選用80只雄性昆明種小鼠隨機分為4組,在飲水中添加不同濃度的鉬(600 mg/L)及銅(3mg/L),建立動物模型。在試驗處理第90天時采樣,研究高鉬低銅對小鼠腎臟組織病理學及TNF-α表達的影響。結果顯示,高鉬組小鼠腎臟組織腎小體聚集,部分腎小球發生萎縮,間質中有大量炎性細胞浸潤,有新月體出現。與對照組相比,高鉬組腎臟TNF-α蛋白表達量上升15.60%(P＜0.01);與低銅組相比,高鉬低銅組腎臟TNF-α蛋白表達量上升24.60%(P＜0.01);與高鉬組相比,高鉬低銅組腎臟TNF-α蛋白表達量上升7.14%(P＜0.05)。表明高劑量鉬導致腎臟發生明顯的病理組織學損傷,顯著提高了小鼠腎臟TNF-α的表達,低銅加劇了鉬的毒性作用。

鉬 ;銅;小鼠 ;腎臟 ;TNF-α

近年來,隨著鉬礦業的快速發展及鉬作為飼料添加劑被廣泛應用于動物生產,鉬對人畜健康的影響也日益明顯。經調查證實,我國河南、陜西、山西、甘肅、江西等省鉬礦附近均存在不同程度的污染,尤其豫西地區鉬儲量極大,居亞洲第一位,世界第三位,礦區周圍環境中鉬含量,遠遠高于其他地區。這就為動物通過采食、飲水等途徑引發鉬中毒提供了物質基礎,是動物健康的嚴重潛在威脅[1-2]。

研究表明,鉬和銅之間在代謝上有明顯的頡頏作用。日糧中鉬含量過高,會使銅的利用率下降,導致機體繼發性銅缺乏[2-3]。也有觀點認為鉬和銅之間又有協同作用,適量的銅是機體吸收鉬所必需的。本研究通過建立高鉬低銅小鼠動物模型,研究高鉬低銅對小鼠腎臟組織病理學損傷及 TNF-α蛋白表達的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 80只21日齡健康雄性昆明種小鼠,購自于鄭州大學實驗動物中心。

1.1.2 主要試劑 鉬酸鈉(Na2MoO4?2H2O)為天津市化學試劑四廠產品;硫酸銅(CuSO4?5H2O)為北京化工廠產品;蘇木素為上?？笊锛夹g有限公司產品;伊紅為上?？笊锛夹g有限公司產品;SABC免疫組化試劑盒為武漢博士德生物有限公司產品;DBA顯色試劑盒為武漢博士德生物有限公司產品。

1.2 方法

1.2.1 試驗設計 選取80只雄性昆明種小鼠,隨機分為4組,在飼喂低鉬低銅飼料基礎上,通過在飲水中添加鉬與銅建立試驗動物模型(表1)。

表1 試驗設計Table 1 Expe rimental design

1.2.2 樣品的采集與制片 在試驗第90天,每組隨機取6只小鼠,迅速取左側腎臟組織后,放入40 mL/L多聚甲醛中固定 24 h。然后放入700 mL/L酒精中,酒精梯度脫水,二甲苯透明,常規石蠟包埋。

1.2.3 小鼠腎臟組織切片的制備及免疫組化實驗利用蘇木精-伊紅染色技術對小鼠腎臟組織形態學進行觀察。并利用SABC免疫組化試劑盒和DBA顯色試劑盒,對小鼠腎臟 TNF-α蛋白表達進行觀察。采用Image-Proplus v.5.1圖像分析軟件(美國MC公司)處理數據,對 TNF-α的表達進行光密度值相關分析,結果采用平均值±標準差表示。

1.2.4 數據處理 SAS 9.0軟件對所得數據進行t檢驗處理,以P＜0.05和P＜0.01作為差異顯著性判定標準。測定結果用平均值±標準差(Mean±SD)表示。

2 結果

2.1 高鉬低銅對小鼠腎臟組織形態學的影響

對照組腎臟組織細胞結構比較清晰,腎小管上皮細胞結構正常(圖1A)。

低銅組部分腎小管中出現透明管型;腎小體體積增大,細胞數量增多;腎小囊腔狹窄呈裂隙狀;腎間質可見少量的淋巴細胞浸潤(圖1B和圖1C)。

高鉬組腎小體聚集;部分腎小球萎縮;腎間質可見大量的炎性細胞浸潤;腎小管腔內出現蛋白管型和細胞分解產物聚集形成的顆粒管型;極少數腎小囊內有新月體形成(圖1D～圖1F)。

高鉬低銅組腎臟組織的部分腎小體萎縮;腎小球和腎小囊發生粘連,整個腎小囊腔發生完全或部分閉塞;出現少量纖維性新月體(圖1G和圖1H)。

圖1 小鼠腎臟組織病理組織學觀察(400×)Fig.1 Histopathological observation in kidney of mice(400×)

2.2 高鉬低銅對小鼠腎臟TNF-α蛋白表達量的影響

TNF-α為胞漿型表達的細胞因子,本試驗采用過氧化物酶使底物發生反應,與反應部位產生棕黃色顆粒狀產物,依據棕黃色顆粒的多少及染色深淺判定陽性強度。由圖2A～圖2F可見,對照組腎臟組織腎小管有特異性著色,形成弱陽性著色帶;低銅組腎臟組織形成的著色帶較對照組顏色淺;高鉬組腎臟組織切片中,陽性細胞胞漿可見散在分布的棕黃色顆粒,表達細胞多分布于腎小管部位;高鉬低銅組腎臟組織切片中,顏色加深的棕黃色顆粒彌漫性分布于腎小管部位。

與對照組相比,高鉬組腎臟TNF-α蛋白表達量顯著上升15.60%(P＜0.01);與低銅組相比,高鉬低銅組腎臟 TNF-α蛋白表達量顯著上升24.60%(P＜0.01);與高鉬組相比,高鉬低銅組腎臟TNF-α蛋白表達量顯著上升7.14%(P＜0.05)(圖3)。

圖2 小鼠腎臟組織免疫組化觀測(400×)Fig.2 Immunohistochemistry observation in kidney of mice(400×)

圖3 高鉬低銅對小鼠腎臟TNF-α蛋白表達量的影響Fig.3 Effect of high molybdenum low copper on TNF-αexpression of kidney in mice

3 討論

腎臟是機體新陳代謝過程中所產生的各種代謝終產物和過剩物質的主要排出器官之一。且腎臟產生的尿中所含的排泄物種類最多、量也最大,作為機體最重要的排泄器官,腎臟也是體內藥物及毒物代謝和排泄的重要器官。微量元素鉬大多數以水溶性(主要是鉬酸鹽)在消化道內被吸收,作為非反芻動物的小鼠,鉬主要在小腸內被吸收。吸收后的鉬隨血液循環可分布于動物所有組織器官和體液中,其中以骨髓、腎臟及肝臟含量最高。當機體攝入過多鉬時,腎臟作為機體對鉬代謝的最主要器官將積聚大量的鉬,從而引起腎臟發生一系列病理變化,影響機體的各項生理功能,表現出相應的癥狀。

本試驗發現,高劑量鉬導致腎臟組織發生明顯的組織形態學損傷,這可能是由于動物機體內鉬含量增加,導致黃嘌呤氧化酶(XO)活力的升高而在機體內會生成大量的超氧化物如超氧陰離子自由基(O2-),同時XO還可促進NO的大量生成等[4-5],氧自由基又會啟動機體的脂質過氧化反應而損傷組織細胞及其大分子物質,這可能是鉬中毒的毒性機理之一[6];同時本試驗發現,鉬攝入過量時,與攝入正常劑量銅的小鼠相比,攝入低劑量的銅的小鼠的腎臟組織形態受到更加嚴重的損傷。原因之一可能為超氧化物歧化酶(SOD)能有效地清除氧自由基,從而抑制脂質過氧化反應,并能穩定細胞膜。當機體內銅減少時,Cu-SOD活力將顯著下降,SOD對氧自由基的清除能力減弱[7]。

細胞因子在一定條件下可加重組織炎癥或免疫損傷,且 TNF-α在感染、組織損傷、炎癥、休克等方面起重要介導作用[8]。近年來還發現TNF-α在中樞神經系統以及許多生物因子誘導的組織損傷過程中也起重要作用[9]。吳小南等曾在慈菇對鎘致急性肝損傷過程中TNF-αmRNA表達的影響中報道,一次大劑量氯化鎘的腹腔注射可誘導肝臟組織TNF-α mRNA的表達顯著升高[10]。本試驗發現,與對照組相比,高鉬組腎臟 TNF-α蛋白表達量上升15.60%(P＜0.01);與低銅組相比,高鉬低銅組腎臟TNF-α蛋白表達量上升24.60%(P＜0.01),說明過量的鉬會導致腎臟組織TNF-α的表達發生極顯著的升高。與高鉬組相比,高鉬低銅組腎臟TNF-α蛋白表達量上升7.14%(P＜0.05),說明高劑量鉬作用下,缺銅導致TNF-α的表達量增加,加劇了高劑量鉬的毒性作用。

綜上所述,高劑量鉬可導致小鼠腎臟組織形態嚴重受損,缺銅后可加劇高劑量鉬對小鼠腎臟組織形態的損傷;高劑量鉬導致腎臟中TNF-α蛋白表達增強,缺銅后使高劑量鉬引起的腎臟TNF-α蛋白表達量增強。

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[2]楊自軍,冉林武,王 婷,等.鋅、銅對鉬中毒綿羊免疫功能的影響[J].中國獸醫學報,2009,29(2):207-209.

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Effect of High Molybdenum Low Copper on the Structure and TNF-αExpression of Kidney in Mice

WANG Hong-wei,ZHOU Bian-hua,ZHANG Liang,ZHANG Sen,HU Wen-fa,YANG Zi-jun

(College of Animal Science and Technology,Henan University of Science and Technology,Luoyang,Hehan,471003,China)

To investigate the effect of molybdenum or copper on the structure and TNF-αexpression of kidney in mice,eighty female Kunming mice were randomly divided into 4 groups.Animal models were established by adding molybdenum(600 mg/L)or copper(3 mg/L)into drinking water.On the 90thday,kidneys were collected to be researched.The results are as follows:In the high molybdenum group,the renal corpuscles closed together,some of them appeared adhesion,plenty of inflammatory cells infiltration,and a little of crescent were observed.Compare with the control group,the lever of TNF-αexpression were significantly increased by 15.60%in the HM group(P＜0.01),The lever of TNF-αexpression were significantly increased by 24.60%in the HMLC group(P＜0.01),compared with the control group.Compare with the HM group,the lever of TNF-αexpression increased by 7.14%in the HMLC group(P＜0.05).The results indicated that,excessive molybdenum induced sever damage in the kidney.The level of TNF-αexpression was obviously increased.Deficiency copper aggravated the molybdenum toxic action in kidney.

molybdenum;copper;mice;kidney;TNF-α

S859.8;S852.31

A

1007-5038(2010)09-0051-04

2010-06-25

河南科技大學博士啟動基金項目(09001368);河南省教育廳自然科學研究計劃項目(2010B230002)

王宏偉(1978-),男,山西朔州人,博士,主要從事動物中毒病研究。