豬蛔蟲不同發育階段09G10基因的表達分析*

黃翠琴,賴芳芳,楊小燕,戴愛玲,李曉華

(1.龍巖學院生命科學學院,福建龍巖 364000;2.龍巖學院預防獸醫學與生物技術福建省高等學校重點實驗室,福建龍巖 364000)

豬蛔蟲不同發育階段09G10基因的表達分析*

黃翠琴1,2,賴芳芳1,楊小燕1,2,戴愛玲1,2,李曉華1,2

(1.龍巖學院生命科學學院,福建龍巖 364000;2.龍巖學院預防獸醫學與生物技術福建省高等學校重點實驗室,福建龍巖 364000)

為進一步鑒定和分析豬蛔蟲感染相關基因,從構建的豬蛔蟲感染期幼蟲消減cDNA文庫中篩選出一基因(EST編號為09G10),以肌動蛋白(β-actin)為內參,采用半定量RT-PCR方法分析該基因在豬蛔蟲不同發育階段的表達情況。通過09G10基因與內參β-actin基因的積分光密度的比值結果顯示,09G10在感染期幼蟲中呈現高豐度表達,在肺第3期幼蟲和第4期幼蟲期有微量表達,在其他各期蟲體包括肝第3期幼蟲、雌蟲、雄蟲和蟲卵均未檢測出該基因的表達量,表明09G10基因可能是豬蛔蟲幼蟲期所特有的基因,在幼蟲感染宿主過程中可能扮演重要角色,為進一步研究該基因的功能提供了依據。

豬蛔蟲;感染期幼蟲;半定量RT-PCR

豬蛔蟲(Ascaris suum)是豬體內常見的寄生蟲,它感染普遍,呈世界性流行,集約化飼養的豬和散養豬均廣泛發生。主要引起仔豬發育不良,生長速度可下降30%。嚴重時發育停滯,形成“僵豬”,甚至造成死亡。我國豬群中豬蛔蟲感染率因地區和飼養條件的不同而有所差距,感染率為17.3%～85.71%[1]。豬蛔蟲病不僅對養豬業造成嚴重的危害,而且對人類健康也構成較大的危害,如幼蟲的移行可造成人體幼蟲移行癥。因此,對豬蛔蟲的研究和控制勢在必行。半定量RT-PCR是近年來用來定量測定特異性mRNA豐度的一種常用方法,主要利用PCR反應的靈敏性和特異性等特點,通過在線性增長期內目的片段的擴增強度與內參強度相比較,判定目的基因的拷貝數。本研究從構建的感染期幼蟲消減cDNA文庫中篩選一基因(EST編號為09G10,基因登錄號為ES291002),應用半定量 RTPCR方法分析該基因在不同發育期的表達情況。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 豬蛔蟲 購自龍巖市某屠宰場。

1.1.2 主要試劑 總RNA提取液Trizol;反轉錄試劑盒ReverTra Ace-α-TM,為TOYOBO公司產品;rTaqDNA聚合酶為寶生物工程(大連)有限公司產品。

1.2 方法

1.2.1 豬蛔蟲不同發育期幼蟲的收集 參照黃翠琴等[2]方法收集不同發育期的豬蛔蟲幼蟲,保存在-70℃備用。

1.2.2 豬蛔蟲各期蟲體總RNA的提取 按Trizol說明書提取蟲體總 RNA,取5 μ L RNA 溶解液,于10 g/L瓊脂糖凝膠中電泳,取2 μ L總RNA測定其在260、280 nm處的光密度,計算A260/A280的值,估計總RNA的純度,通過A260值對總 RNA進行定量。剩余的 RNA溶液貯存于-70℃備用。

1.2.3 逆轉錄反應 根據ReverTra Ace-α-TM試劑盒說明書進行。根據不同樣品RNA濃度調整加入的RNA 的體積,使RNA 初始量一致,都為1 μ g。

1.2.4 PCR反應

1.2.4.1 引物 選用豬蛔蟲的β-actin基因為內參,參照鄧艷[3]設計的引物擴增;β-actin基因的上游引物 :5′-CTCGAAACAAGAATACGATG-3′;下游引 物 :5′-ACATGTGCCGT TGTATGATG-3′。 用Oligo軟件結合手工分析的方法設計基因09G10的一對 引物,上游引物 :5′-GAGCAGAAGCAAATGTTAGG-3′;下 游 引 物 :5′-GCAGAGACAGGCAGATACAG-3′。

以上引物由上海英駿公司合成,使用時加滅菌雙蒸水稀釋成10 pmol/μ L,分裝后于-20℃保存備用。

1.2.4.2 PCR反應條件優化 參照鄧艷[3]的PCR反應體系,優化Mg2+濃度、退火溫度及循環次數,獲得適宜的實驗參數,建立能穩定擴增09G10和βactin基因片段的有效的半定量PCR檢測體系。

1.2.4.3 09G10基因在不同發育期的表達分析采用以上優化好的RT-PCR條件研究09G10基因在不同發育期的表達情況。反應在同一次PCR反應中進行。PCR產物在瓊脂糖凝膠中電泳。用凝膠成像系統對電泳條帶進行光密度分析,以目的基因09G1和內參β-actin基因的積分光密度的比值代表目的基因的mRNA含量。凝膠成像和定量分析采用英國UVITEC公司的UVIsoft圖像采集和分析軟件。

2 結果

2.1 不同發育期蟲體總RNA提取及純度檢測

采用Trizol提取豬蛔蟲各期蟲體的總RNA,提取后用已加入溴化乙錠的10 g/L瓊脂糖凝膠進行電泳,由圖1可以看到28 S、18 S核糖體 RNA條帶較清晰,其他RNA條帶比較模糊,表明所提取的總RNA未降解。核酸蛋白測定儀檢測提取的總RNA,各期蟲體RNA的A260/A280比值均在1.8～2.0之間。

圖1 豬蛔蟲各發育期蟲體總RNA瓊脂糖電泳圖Fig.1 Analysis of total RNA from different stages of Ascaris suum by agarose gel electrophoresis

2.2 半定量RT-PCR產物循環數的確定

本試驗分別在 20、22、25、27、30個循環時對09G10基因片段進行擴增,電泳結果(圖2)經凝膠成像系統掃描分析,以各電泳條帶的光密度值(光密度曲線峰面積)作為縱坐標,循環次數為橫坐標作圖(圖3)。從圖3可見,09G10到27個循環,擴增在指數增長期,因此在正式試驗中對該基因采用26個循環數,內參β-actin基因參照鄧艷[3]的論文選用25個循環。

圖2 不同擴增循環數對09G10基因產物的電泳分析Fig.2 Electrophoretic analy sis for products of different cy clee numbers of 09G10 gen

圖3 09G10基因不同擴增循環數電泳條帶IOD值分析圖 Fig.3 Analy sis of IOD for the different cycle number of 09G10 gene

2.3 09G10基因半定量RT-PCR分析

看家基因β-actin在蟲體中穩定表達,見圖4。將目的基因PCR擴增產物和內參基因擴增產物混合后,加入同一個電樣孔進行電泳(圖5),用 UVI-soft圖像采集和分析軟件測出每條條帶的完整光密度值。以目的基因與內參基因的光密度比值代表該基因在不同發育期的表達量。試驗的研究結果發現,該基因在感染期幼蟲中呈現高豐度表達,在肺第3期幼蟲和第4期幼蟲期有微量表達,在其他各期蟲體包括肝第3期幼蟲、雌蟲、雄蟲和蟲卵均未檢測出該基因的表達量(表1和圖6)。

圖4 β-actin基因在不同發育期蟲體的PCR產物電泳分析Fig.4 Electrophoretic analysis of β-actin gene PCR products in different developmental stages of A.suum

圖5 09G10基因在不同發育期的表達情況電泳分析Fig.5 Electrophoretic analysis of expression of 09G10 genes in different developmental stages of A.suum

表1 豬蛔蟲感染期幼蟲基因克隆09G10和β-actin PCR產物電泳相應條帶的光密度比值Table 1 The IOD ratio of the PCR products of 09G10 gene andβ-actin gene in infective larvae of A.suum

圖6 09G10基因在不同發育期的表達情況分析Fig.6 Analysis of expressed 09G10 gene of different developmental stages

3 討論

本研究從已構建的豬蛔蟲感染期幼蟲消減cDNA文庫中篩選一基因(09G10),采用RT-PCR對該基因在不同發育期蟲體的mRNA豐度進行了半定量分析。半定量RT-PCR是近年來用來定量測定特異性mRNA豐度的一種常用方法,主要利用PCR反應的靈敏性和特異性等特點,通過在線性增長期內目的片段的擴增強度與內參強度相比較,判定目的基因的拷貝數。該方法的優點是mRNA經反轉錄后PCR數次循環,產物的量以指數形式增長,即使模板濃度較低也能檢測到[4],目前已被國內外許多學者用于檢測mRNA表達豐度[5-8]。該技術的關鍵是優化試驗條件,尋求PCR線性擴增范圍,確定最適Mg2+濃度和PCR循環次數。選擇合適的看家基因很關鍵,本試驗選用的是豬蛔蟲的β-actin基因,此基因在各個發育期幾乎均勻表達[9]。由于內參的豐度一般遠遠大于目的基因的豐度,所以使二者同時都在線性范圍內擴增,往往使內參已飽和了而目的基因的條帶還不清晰,因此,本試驗采用同一次PCR反應,但內參基因在鄧艷[3]研究的基礎上,選用25個循環,目的基因根據其循環數的光密度值,到27個循環,擴增在指數增長期,因此試驗中選擇26個循環數進行擴增,從而保證目的基因和內參的擴增都在線性增長期。

本研究結果表明,目的基因09G10在豬蛔蟲感染期幼蟲中呈高豐度表達,在肺第3期幼蟲和第4期幼蟲期有微量表達,在其他各期蟲體包括肝第3期幼蟲、雌蟲、雄蟲和蟲卵均未檢測出該基因的表達量。生物信息學分析顯示,09G10與編碼秀麗新桿線蟲的Poly(A)結合蛋白(PABP)的基因有70%的相似性。PABP是一類可以與mRNA 3′端Poly A結合的高度保守的蛋白質,參與mRNA的翻譯并調節其穩定性,在不同的細胞類型中存在種類和功能各異的PABP。在早期發育過程中,卵母細胞中儲存大量母源性mRNA以備在合子基因激活前合成發育所需的蛋白質。母源性mRNA的翻譯起始和沉默受到嚴格的調控,此調控過程需要PABP的參與。在爪蟾中發現一種新的Poly(A)結合蛋白,命名為ePAB,在爪蟾Ⅵ期卵母細胞及早期胚胎中表達[10]。Seli E等[11]利用RT-PCR和原位雜交技術檢測到ePAB的mRNA存在于小鼠PⅠ、MⅡ期卵母細胞和一、二細胞胚胎中,而在四細胞以后就檢測不到其mRNA了。而且,PAB的mRNA只特異性地表達于小鼠的卵巢、睪丸和早期胚胎。由此可見,ePAB參與了爪蟾和小鼠配子發生以及早期胚胎發育過程中的基因表達調控,特別是母源性mRNA的翻譯激活和沉默的調控。本試驗中09G10在感染期幼蟲、肺第3期幼蟲和第4期幼蟲期中有不同程度的表達,可能是豬蛔蟲幼蟲期所特有的,推測該基因在豬蛔蟲幼蟲的發育過程中可能參與前體mRNA的成熟,啟動mRNA的翻譯,并調節其穩定性。目前對 PABP的研究還存在空白,至今還沒有發現PABP在翻譯起始時由PABP介導的復合物的所有組分,對其在發育過程中的作用還不是很清楚,因此研究PABP的功能對揭示寄生線蟲的發育具有重要意義。

[1]陳 寧,黃翠琴,朱興全.豬蛔蟲的生活史及體外培養研究進展[J].熱帶醫學雜志,2006,2(2):220-222.

[2]黃翠琴,陳 寧,鄒豐才,等.豬蛔蟲不同發育期幼蟲的收集方法研究[J].熱帶醫學雜志,2006(5):487-489.

[3]鄧 艷.豬蛔蟲雄蟲cDNA文庫的構建及性別差異表達基因的篩選和鑒定[D].廣東廣州:華南農業大學,2006:38-49.

[4]張 翔,王寒正,龔岳亭,等.RT-PCR測定 mRNA的熒光定量分析[J].生物化學與生物物理學報,1998,30(1):70-73.

[5]周林福,陳離偉,姜云水,等.熒光定量PCR與半定量PCR檢測HBVDAN的對比分析[J].中國病理生理雜志,2005,21(5):838-867.

[6]張麗娜,牛吉山,于 嶺.用半定量 RT-PCR方法分析小麥TaMlo-Alc基因的表達[J].西北植物學報,2005,25(7):1368-1371.

[7]T ran M T,Lausch R N,Oakes J E.Substance P differentially stimulates IL-8 sy nthesis in human corneal epithelial cells[J].Inwest Ophthalmol Vis Sci,2000,41(12):3871-3873.

[8]Marone M,M ozzetti S,Ritis D D,et al.Semiquantitative RTPCR analysis to assess the expression levels of multiple transcripts from the same sample[J].Biol Proceed Online,2001,3(1):19-25.

[9]M c Neel R L,M ersmann H J.Distribution and quantification of betal-,beta2-,and beta3-adrenergic receptor subtype transcripts in porcine tissues[J].J Anim Sci,1999,77(3):611-612.

[10]Voeltz G K,Ongkasuwan J,Standart N,et al.A novel embry onic poly(A)binding protein,ePAB,regulates mRNA deadenylation inXenopusegg extracts[J].Genes Dev,2001,15(6):774-788.

[11]Seli E,Lalioti M D,Flaherty S M,et al.An embryonic poly(A)-binding protein(ePAB)is ex pressed in mouse oocytes and early preimplantation embryos[J].Proc Natl Acad Sci USA,2005,102(2):367-372.

Expression Analysis of 09G10 Gene in Different Developmental Stages ofAscaris suum

HUANG Cui-qin1,2,LAI Fang-fang1,YANG Xiao-yan1,2,DAI Ai-ling1,2,LI Xiao-hua1,2

(1.College of Li fe Sciences,Longyan University,Longyan,Fujian,364000,China;2.K ey Laboratory of Preventive Veterinary Medicine and Biotechnology Longyan University,Longyan,Fujian,364000,China)

To identify and analyze the gene related with infection ofAscaris suumin this study,the gene 09G10 was selecte from the suppression subtractive hybridization(SSH)of infective larvae ofA.suum.The gene expression levels were analyzed at different stage worms,using semi-quantitative RT-PCR method,with actin(β-actin)gene as internal control.Visualization of RT-PCR products of β-actin in all the stages under UV-light exposure was used to confirm equal template.The results showed that the expression level of the gene 09G10 in the infective larva is the highest and much more than L3 stage in lung and L4;no expression were tested in eggs,L3 stage in liver,male and female.T he results provide a foundation for further studying the developmental processes and infectivity ofA.suum.

Ascaris suum;infective larva;semi-quantitative RT-PCR

S852.731;Q786

A

1007-5038(2010)08-0060-04

2010-07-01

資金項目:福建省自然科學基金項目(2008J0070);福建省教育廳科技計劃A類項目(JA08232)

黃翠琴(1978-),女,福建人,博士,主要從事寄生蟲功能基因組學研究。