鵝細小病毒不同毒株VP13基因的克隆與序列分析*

韋艷梅,曹宗喜,廖 明,張桂紅,鄭煦燦,單 芬,羅開健

(華南農業大學獸醫學院,廣東廣州 510642)

鵝細小病毒不同毒株VP13基因的克隆與序列分析*

韋艷梅#,曹宗喜#,廖 明,張桂紅,鄭煦燦,單 芬,羅開健*

(華南農業大學獸醫學院,廣東廣州 510642)

分別將鵝細小病毒(GPV)的5個分離株通過PCR技術,從病毒基因組DNA中擴增出病毒蛋白VP1和VP3非重疊區的基因片段(VP13基因),并與pMD18-T質粒載體連接,轉化到感受態大腸埃希菌Top10中,經PCR鑒定后,對插入片段進行序列測定及分析。結果表明,5株GPV VP13基因全長均為594 bp,編碼198個氨基酸。不同毒株主要結構蛋白VP13基因與國外已發表的鵝細小病毒B株核苷酸序列相似性較高(93.4%～98.7%),但毒株間也存在一定差異。

鵝細小病毒;VP13基因;克隆;序列分析

同等貢獻

鵝細小病毒(Goose parvovirus,GPV)是感染禽類的主要自主性細小病毒,由它引起的鵝細小病毒病又名小鵝瘟,嚴重危害養鵝業[1-3]。GPV屬細小病毒科濃核病毒屬[4],其基因組DNA為單鏈、線性DNA,大小約為5.0 kb;含有正鏈DNA和含有負鏈DNA的病毒粒子數目基本相等,各占50%。GPV基因組中含有2個主要開放閱讀框架(ORF)[5-6],左側ORF(LORF)編碼非結構蛋白(NS),右側ORF(RORF)編碼 3種結構蛋白(VP)VP1、VP2和VP3,其中編碼VP1、VP3的啟動密碼子ATG分別位于2 439 bp和3 033bp處,編碼VP2的啟動密碼子為不典型的ACG,位于2874 bp處。編碼3種結構蛋白的終止密碼子位點相同,位于4 635 bp處。VP1、VP2和VP3基因的核苷酸全長分別為2 199、1 764、1 605 bp[7]。VP1與VP3基因的核苷酸非重疊序列共594 bp(以下簡稱VP13基因)。VP3為GPV的主要結構蛋白,是病毒核衣殼的主要成分,約占總蛋白含量的80%,且暴露于病毒粒子表面[5],是病毒刺激機體產生保護性抗體的重要抗原蛋白。在自然感染條件下,GPV誘導產生抗VP3的中和抗體,故VP3基因是研制基因工程疫苗的首選基因。為區分鑒別自然感染和接種VP3基因工程疫苗而產生的抗體,本試驗針對不同毒株,進行VP1和VP3非重疊基因序列的克隆,為后期制備檢測自然感染的診斷抗原和標記探針奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒 5株鵝細小病毒分別為SCh株(四川株)、F株(佛山株)、DB3株(東北株)、H 株(東北株)和Q株(東北株)由華南農業大學獸醫學院傳染病實驗室分離保存。

1.1.2 質粒和菌株 pMD-18T載體購自寶生物工程(大連)有限公司,大腸埃希菌DH5α為華南農業大學獸醫學院傳染病實驗室保存。

1.1.3 主要試劑 ExTaqDNA聚合酶購自寶生物工程(大連)有限公司;DNA抽提試劑盒、膠回收(小量)試劑盒、質粒(小量)抽提試劑盒購自上海生工生物工程技術服務有限公司。

1.2 方法

1.2.1 病毒增殖及鑒定 將病毒適當稀釋后,經尿囊腔接種9日齡的非免疫鴨胚,收集接種后72 h～240 h死亡的鴨胚尿囊液,經PCR檢測陽性者置-20℃凍存備用。

1.2.2 引物設計與合成 根據已發表的GPV B株全基因組核苷酸序列設計一對引物擴增VP13基因,上游 P1:5′-CCGGGATGTCTACTT TT T TAGA-3′;下游 P2:5′-CGT TAT TCAGATGCTGCC-3′,由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.2.3 PCR擴增 將含有GPV的尿囊液按照DNA抽提試劑盒操作說明書進行DNA模板的提取。DNA進行PCR反應,PCR反應體系為:模板2 μ L,50 pmol上 、下游引物各 1 μ L,4種 dNTP 分別為5 μ L,ExTaqDNA 聚合酶(5 U/μ L)0.5 μ L,加水至 50 μ L 。PCR反應條件為:97℃30 s,50℃1 min,72℃2 min,30個循環;最后72℃延伸10 min。PCR產物經10 g/L瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定。

1.2.4 GPV VP13基因的克隆及鑒定 將擴增的PCR產物按一定比例與pMD-18T載體連接,連接產物轉化Top10感受態細胞,經PCR鑒定陽性菌液擴大培養并抽提質粒,置-40℃冰箱備用。

圖1 VP13基因PCR擴增結果Fig.1 PCR amplification result of VP13 gene of GPV

1.2.5 序列分析與比較 將轉入重組載體的感受態細菌Top10,同時送上海生工生物工程技術服務有限公司和上海英駿生物技術有限公司廣州分公司進行測序。通過Blast得到一些與試驗毒株一致性較高的國外發表序列,并用 DNA Star軟件中的Clustal W Method將這些序列進行一致性比較。

2 結果

2.1 PCR產物擴增

PCR產物經10 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定,獲得大小約為0.6 kb的片段(圖1)。

2.2 菌液PCR檢測

菌液PCR產物經 10 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定,獲得大小約為0.6 kb的片段(圖2)。

圖2 VP13基因菌液PCR擴增結果Fig.2 PCR amplification result of VP13 gene of GPV in bacterial culture

2.3 序列測定分析

5株GPV的VP13基因序列測定結果如圖3,由其推導氨基酸序列如圖4。測定及分析結果顯示,5株GPV的VP13基因全長均為594 bp,編碼198個氨基酸,將此序列與GPV B株的VP13基因序列進行比較,核苷酸序列相似性如圖5所示,其推導氨基酸序列一致性如圖6所示。

3 討論

本試驗對GPV Sch株、F株、DB3株、H 株和 Q株的VP13基因進行了克隆和序列測定及分析,結果表明,SCh、F、DB3、H 和 Q 這 5株GPV VP13基因核苷酸序列長度均為594bp,編碼198個氨基酸。它們的VP13序列與國外發表的GPV B株VP3基因核苷酸序列相比較,除個別突變點外,大多數變異集中在VP13基因5′端,核苷酸序列相似性分別為93.4%、96.8% 、98.7%、98.5%和 96.8%;由這些序列推導的氨基酸序列較GPV B株的突變主要集中在28位和59位氨基酸之間,這一區域可能是VP13基因的高變區,氨基酸序列相似性分別為94.9%、97.5%、98.0%、97.5%和 97.5%。

Strassheime M L等[8]研究犬細小病毒衣殼蛋白時發現有2個決定中和抗體產生位點區,分別位于纖突頂端和VP2第300氨基酸殘基周圍及三倍體纖突的“肩”部,它們的堿基突變可引起病毒抗原性的變化。犬細小病毒衣殼蛋白中有10個抗原表位,免疫吸附試驗證實,其中6個位于病毒表面;6個中又有3個位于VP2氨基端,另外的3個位于病毒三重對稱軸上形成“穗狀突起”的VP2的“環”上,是刺激機體產生中和抗體的主要部位[9]。通過X射線技術,犬細小病毒(CPV)、貓細小病毒(FPV)、小鼠細小病毒(MVM)、人細小病毒B19的三維結構已被證實。其中VP2是構成病毒表面“穗狀突起”的成分之一,VP2的第93、300、301、426位氨基酸殘基對病毒和單抗的結合能力有一定的影響,在VP2氨基酸序列的第95位和第200位之間有B細胞識別位點[8]。基于以上研究,結合本試驗結果,推斷GPV的VP13的3′端可能具有B細胞識別位點。

圖3 5株GPV VP13基因測序結果與國外已發表序列(GPV B株)的比較Fig.3 Comparison of nucleotide sequences of VP13 gene between 5 goose parvovirus strains and B strain

圖4 5株GPV VP13基因推導的氨基酸序列與國外已發表序列(GPV B株)的比較Fig.4 Comparison of the deduced amino acid sequence of VP13 gene between 5 goose parvovirus strains and B strain

圖5 5株GPV VP13與GPV B VP13的基因進化樹分析Fig.5 Phy logenetic tree analy sis between the 5 strains of GPV-VP13 gene and GPV-B-VP13 gene

圖6 5株GPV VP13基因推導氨基酸與GPV B VP13基因推導氨基酸的進化樹分析Fig.6 Phylogenetic tree analysis between the 5 strains of deduced aminoacids of GPV-VP13 gene and GPV-B-VP13 gene

Morinet F 等[10]、Le Gall-Recule G 等[11]和Takehara K等[12]應用相同的表達體系研究表明,細小病毒的結構蛋白(VP1、VP2和VP3)可刺激機體產生中和抗體,通過體外表達細小病毒的該結構基因,制備重組抗原,可通過檢測抗體對病原進行檢測。由于GPV的培養和增殖常用鵝胚,因此常規全病毒抗原的制備存在諸多不便。此外,GPV分離株的抗原性均非常接近,僅表現一個血清型,與本屬其他病毒無血清學交叉反應。因此,利用VP1與VP3非重疊基因序列表達產物作為抗原和用該區段的核苷酸序列作為標記探針,在細小病毒病特異性診斷以及區分VP3基因工程疫苗接種和野毒感染中具有良好的應用前景。

[1]殷 震,劉景華.動物病毒學[M].2版.北京:科學出版社,1997:1165.

[2]趙麗榮,張桂紅,廖 明.鵝細小病毒的分離鑒定[J].中國獸醫雜志,2009,45(1):45-46.

[3]Eerns B.Parvoviridae:The viruses and their replication[A].Fields B N Eds Fields[M].Virology(3rd ed).Lippincott-Raven Publishers,1996:2173-2197.

[4]Qiu Jianming,Cheng Fang,Yuko Y,et al.T he expression strategy of goose parvovirus exhibits features of both the dependovirus and parvovirus genera[J].J Virol,2005,79(17):11035-11044.

[5]Zadori Z,Stefaancsik R,Rauch T,et al.Analysis of complete nucleotide sequence of g ooseand mucovy duck parvovriuses indicates common ancestral o rigin with adeno-associated virus 2[J].Virology,1995,212:562-573.

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[12]T akehara K,Nakata T,Takizawa K,et al.Ex pression goose parvovirus VP1 capsid protien by a baculovirus expression system and establishment of fluorescent antibody test diagnose g oose parvovirus infection[J].Arch Virol,1999,144(8):1639-1645.

Cloning and Sequencing of non-repeated VP1 and VP3 Genes of Different Goose Parvovirus Strains

WEI Yan-mei,CAO Zong-xi,LIAO Ming,ZHANG Gui-hong,ZHENG Xu-can,SHAN Fen,LUO Kai-jian

(College of Veterinary Medicine,South China Agricultural University,Guangzhou,Guangdong,510642,China)

In this article,non-repeated VP1 and VP3 genes of different Goose parvovirus strains were amplified from the DNA by(PCR,the non-repeated VP1 and VP3 genes(VP13)were cloned into pMD18-T vector respectively.The recombinant plasmids were identified by PCR and then sequenced.The result of sequence analysis showed that non-repeated VP1 and VP3 gene had 594 bp and included a complete open reading frame which encoding a protein of 198 amino acids,and all the 5 strains of GPV shared highly common identity compared with GPV B strain(93.4%-98.7%),but there were also some differences between different strains.

Goose parvovirus;VP3 gene;cloning;sequencing

S852.659.2

A

1007-5038(2010)08-0055-05

2010-01-05

韋艷梅(1986-),女,廣西百色人,碩士研究生,主要從事病毒分子生物學研究。*通訊作者 #對本文有