龍葵生物堿誘導HeLa細胞凋亡的研究*

賈艷菊,代 玲,張 燦

(1.河北經貿大學生物科學與工程學院,河北石家莊 050061;2.邢臺醫學高等專科學校基礎部,河北邢臺 054000;3.青島農業大學動物科技學院,山東青島 266109)

龍葵生物堿誘導HeLa細胞凋亡的研究*

賈艷菊1,代 玲2,張 燦3*

(1.河北經貿大學生物科學與工程學院,河北石家莊 050061;2.邢臺醫學高等專科學校基礎部,河北邢臺 054000;3.青島農業大學動物科技學院,山東青島 266109)

用M TT法觀察龍葵生物堿的體外抗腫瘤作用,用T UNEL染色法檢測龍葵生物堿對HeLa細胞凋亡的影響,用免疫細胞化學方法研究龍葵生物堿對HeLa細胞PCNA和突變型P53蛋白表達的影響。濃度為100 μ g/mL～800 μ g/mL的龍葵生物堿對HeLa細胞的生長均表現出一定的抑制作用;TUNEL染色結果提示400 μ g/mL的龍葵生物堿處理HeLa細胞48 h后,能夠誘導更多的細胞出現凋亡;免疫細胞化學分析結果顯示,400 μ g/mL的龍葵生物堿處理HeLa細胞48 h后,會使HeLa細胞中PCNA蛋白和突變型P53蛋白表達量顯著下調。結果表明,龍葵生物堿在體外具顯著抗宮頸癌活性,其作用機制是通過誘導更多的細胞出現凋亡而實現的。

龍葵生物堿;MT T;T UNEL染色;PCNA;突變型P53;HeLa細胞

中藥龍葵(Solanum nigrumL)是茄科植物龍葵的地上部分,其全草含多種甾體生物堿,包括澳洲茄邊堿(solamargine)、澳洲茄堿(solasonine)、龍葵堿(solanine)等,也含皂甙等成分。生物堿類化合物大多都能誘導腫瘤細胞凋亡,細胞凋亡與腫瘤的發生密切相關,腫瘤的發生可能是由于細胞凋亡的通路受阻造成的[1-2]。一些研究報道表明,龍葵的醇提物能夠抑制乳腺癌的生長并能誘導細胞凋亡[3],其中的澳洲茄邊堿有明顯的抗腫瘤作用[4]。龍葵制劑對無轉移惡性葡萄胎、手術切除放療、化療后絨毛膜癌、卵巢癌藥物作用機制研究已經展開;對食道癌、膀胱癌抑制機制的研究已有報道[5],但龍葵生物堿對宮頸癌的治療作用國內外尚未見相關報道。

本試驗將分離提取的龍葵生物堿作用于人宮頸癌細胞株(HeLa),進行體外培養試驗,觀察藥物對該細胞株增殖的影響,并進一步探討龍葵生物堿抑制細胞增殖的作用機制,為進一步開發利用龍葵提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 龍葵生物堿 龍葵購于青島市同仁堂藥店,經同仁堂醫師鑒定為龍葵。龍葵生物堿的提取參考龐琳琳等[6]的提取方法,并適當改進。

1.1.2 供試細胞 人宮頸癌HeLa細胞株購于中國醫學科學院。

1.1.3 主要試劑 超級無支原體胎牛血清、RPMI1640、青霉素、鏈霉素、胰蛋白酶購于Gibco公司;M TT為Sigma公司產品;鼠抗人單克隆抗體P53、PCNA,羊抗鼠單克隆抗體IgG-H RP為Santa Cruz公司產品;T UNEL染色試劑盒購于Roche公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 人宮頸癌HeLa細胞株,以含100 mL/L胎牛血清、1萬單位青霉素、100 mg/L鏈霉素的 RPMI1640培養基,在37℃、50 mL/L的CO2條件下培養。5 g/L胰酶與1 g/L EDTA等體積混合消化細胞,隔日傳代1次。

1.2.2 細胞存活率 參照文獻[7]介紹方法進行。細胞接種于96孔培養板,每孔接細胞1.0×104個。培養 24 h,加入不同濃度(10、50、100、200、400、800 μ g/mL)的藥物 10 μ L(以 RPMI1640 培養液稀釋),對照組加入同體積的RPMI1640培養液,每組設3個平行孔,充分混勻后,繼續培養48 h。每孔加入 MT T 20 μ L(5 g/L,PBS),繼續培養 4 h后 ,每孔加入DMSO 150 μ L,充分震蕩溶解,Multiscan MK3型酶標儀在492 nm波長處測定各孔OD值,調零孔則用RPMI1640代替細胞懸液和藥物。試驗重復3次。細胞生長抑制率按下列公式進行計算:

生長抑制率(IR%)=[1-試驗組平均OD值/對照組平均OD值]×100%

1.2.3 TUNEL染色檢測細胞凋亡 經藥物處理后及對照組細胞制成單細胞懸液,調節細胞濃度為5×106個細胞/mL,制備細胞涂片(40 mL/L多聚甲醛固定),然后按試劑盒說明書操作。顯微鏡下觀察細胞中含有藍紫色顆粒的細胞即為凋亡的細胞。以上試驗重復二次。

1.2.4 突變型P53和PCNA蛋白免疫細胞化學分析 用400 μ g/mL龍葵生物堿處理后及對照組細胞用PBS液制成單細胞懸液,調節細胞濃度為2×106個細胞/mL,滴片,室溫下自然干燥,然后按試劑盒說明書進行操作。以2×105個細胞/孔接種于放置有蓋玻片的6孔板,待自然貼壁后藥物處理48 h后取出置于培養皿中長滿細胞的蓋玻片,免疫細胞化學檢測試劑盒進行SP法免疫組化染色,光鏡低倍鏡下隨機確定5個視野,每個視野隨機計數200個腫瘤細胞計算突變型P53和PCNA陽性率。

1.2.5 統計分析 用Statisticas 6.0統計軟件對結果進行分析,細胞存活率組間差異采用單因素方差分析、多重比較采用鄧肯檢驗,突變型P53和PCNA陽性率的組間差異采用t檢驗。P＜0.05,為統計學差異顯著。

2 結果

2.1 龍葵生物堿對腫瘤細胞生長的抑制作用

試驗結果表明,不同處理組的OD值存在顯著差異(F(7,16)=189.5,P=0.00),各龍葵生物堿處理組OD值與空白對照組的相比差異顯著(P＜0.05),并且隨濃度的增加OD值逐漸降低。質量濃度為100 μ g/mL～800 μ g/mL的龍葵生物堿對He-La細胞的生長表現出一定的抑制作用,且隨著濃度的增加抑制率逐漸增加(F(6,14)=140.8,P=0.00),當濃度為800 μ g/mL時,龍葵生物堿對 HeLa細胞增殖抑制率可達69.27%,與陽性藥物5-Fu處理效果無顯著差異(P＞0.05)(表1)。

表1 龍葵生物堿對HeLa細胞的增殖抑制作用Table 1 Effect of solanine on proliferative activity of HeLa cell line in vitro(±SD)

表1 龍葵生物堿對HeLa細胞的增殖抑制作用Table 1 Effect of solanine on proliferative activity of HeLa cell line in vitro(±SD)

注:上標字母不同,表示差異顯著P＜0.05。Note:Values with different letters show significant difference P＜0.05.

濃度/(μ g?mL-1)Concentration OD值OD value IR/%Control 1.178±0.018f 10 1.088±0.024e 7.64±3.24a 50 1.017±0.070e 13.67±6.28a 100 0.789±0.023d 33.02±1.94b 200 0.660±0.043c 43.97±4.25c 400 0.521±0.021b 55.77±1.42d 800 0.362±0.074a 69.27±4.42e 5-Fu 0.342±0.018a 70.97±1.43e

2.2 龍葵生物堿對HeLa細胞凋亡的影響

DNA片段化是細胞凋亡的一個標志,TUNEL染色結果如圖1所示。與陰性對照組相比,濃度為400 μ g/mL龍葵生物堿處理的HeLa細胞,TUNEL染色后的細胞爬片出現強烈綠色熒光,提示龍葵生物堿在體外能顯著誘導更多的HeLa細胞發生凋亡。

2.3 龍葵生物堿對HeLa細胞P53蛋白、核增殖抗原(PCNA)蛋白表達的影響

為了進一步闡明龍葵生物堿誘導細胞凋亡的途徑,通過免疫組織化學的方法檢測龍葵生物堿處理后對HeLa細胞突變型P53和PCNA蛋白表達的影響,結果如圖2和圖3所示。從結果中可以看出,龍葵生物堿處理可以使HeLa細胞突變型p53蛋白表達陽性細胞顯著減少(30.3%±7.7%),與陰性對照組(87.1%±8.9%)相比,差異極顯著(P＜0.01);龍葵生物堿可以使HeLa細胞PCNA蛋白表達陽性細胞顯著減少,陽性表達率為29.5%±9.2%,與陰性對照組(61.7%±7.1%)相比,差異也達顯著水平(P＜0.05)。

圖1 龍葵生物堿處理對HeLa細胞凋亡的影響Fig.1 Effect of solanine on the HeLa cell apoptosis

圖2 龍葵生物堿處理對HeLa細胞PCNA蛋白表達的影響Fig.2 Effect of solanine on the PCNA protein expression of HeLa cells

圖3 龍葵生物堿處理對HeLa細胞突變型P53蛋白表達的影響Fig.3 Effect of solanine on the mutant P53 protein expression of HeLa cells

3 討論

子宮頸癌是婦科臨床比較常見的惡性腫瘤,可分為鱗狀細胞癌、腺癌及其他類,其中鱗狀細胞癌約占85%～90%。近幾年來研究表明,腫瘤的發生不僅是由于細胞的無限生長,而且細胞生長抑制因子的喪失及細胞凋亡的異常同樣會引起腫瘤的形成。

植物生物堿是一類有廣泛生物活性效應的成分,近些年的研究表明,多種植物生物堿均顯示出了較強的抗腫瘤活性,如馬齒莧生物堿對A-549肺癌細胞株[8]、野西瓜生物堿對 HepG-2細胞株均顯示出很強的抗增殖活性[6]等。其抗腫瘤作用的機理與對細胞的直接殺傷作用[9]、干擾細胞周期作用[10]、誘導細胞分化[11]、誘導細胞凋亡[12]、逆轉細胞抗凋亡作用[13]等有關。本試驗首次觀察了龍葵生物堿對人宮頸癌HeLa細胞增殖作用的影響,結果表明,龍葵生物堿體外對HeLa細胞的增殖具有較好的抑制作用,且隨龍葵生物堿濃度的增加而抑制效果增強,在處理濃度為800 μ g/mL時,細胞增殖抑制率可達69.27%。T UNEL染色結果顯示,龍葵生物堿處理以后,細胞爬片的熒光強度與陰性對照組相比顯著增強,提示龍葵生物堿誘導了更多的細胞出現凋亡。

增殖細胞核抗原(PCNA)是DNA多聚酶δ的輔助蛋白,在細胞周期的G1后期開始增加,S期達到高峰,直接參加了細胞增殖過程中的DNA復制,其表達和含量反映了細胞的增殖活性。PCNA等抗原表達可作為預測腫瘤對化療藥物的敏感程度[14],免疫細胞化學檢測結果表明,龍葵生物堿處理后,PCNA蛋白表達量顯著降低,提示藥物處理使細胞增殖活性顯著降低,該結果與M TT試驗結果相一致。

與野生型P53作為一種腫瘤抑制基因不同,突變型P53是一種癌基因,它的過量表達可能通過使細胞更易增殖而增加了細胞的穩定性,并且它還可以抑制DNA的修復和凋亡。除此之外,還有文獻表明突變型P53可以激活端粒酶、激活抗血管生成因子的形成以及促進腫瘤細胞的轉移。更為重要的是,有研究表明P53的突變與Bcl-2的過量表達有關[15]。利用免疫細胞化學方法檢測到的是突變型P53的表達,從試驗結果來看,龍葵生物堿處理后可以使HeLa細胞突變型P53蛋白的表達量顯著下調,提示龍葵生物堿可能通過下調突變型P53而修復野生型P53功能,進而誘導細胞出現更多的凋亡。

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Study on Apoptosis of HeLa Cells Induced by Solanine

JIA Yan-ju1,DAI Ling2,ZHANG Can3

(1.College of Biological Science and Engineering,Hebei University of Economics&Business,Shijiazhuang,Hebei,050061,China;2.Foundation Department,Xingtai Medical College,Xingtai,Hebei,054000;3.College of Animal Science,Qingdao Agriculture University,Qingdao,Shandong,266109,China)

MTT method was used to explore the anti-neoplastic action of solaninein vitro,T UNEL staining was used to analyze the apoptosis-inducing effect of solanine on HeLa cell line,and immumunocytochemistry method was further used to detect the effects of solanine on the protein expression of PCNA and mutant P53 in HeLa cell line.100 μ g/mL-800 μ g/mL solanine had certain inhibition effect on the growth of HeLa cell line.TUNEL staining results showed that after the treatment of solanine at a dose of 400 μ g/mL for 48 h,more HeLa cells were induced to apoptosis.Immumunocytochemistry analysis showed that after the treatment of solanine at a dose of 400 μ g/mL for 48 h,the expression of PCNA protein and the mutant P53 protein were all down-regulated in HeLa cells.T hese results indicated that solanine had significant anticervical cancer effectin vitro,and its anti-tumor mechanism be correlated with its cell apoptosis-inducing action.

solanine;MTT;T UNEL staining;PCNA;mutant P53;HeLa cell

R285

A

1007-5038(2010)08-0051-04

2010-01-15

賈艷菊(1977-),女,河北石家莊人,講師,博士,主要從事水生生物學研究。*通訊作者