豬腦心肌炎病毒GXLC株VP1基因的克隆與序列分析*

陳進喜,施開創,屈素潔,鄭 敏,李向濤,陳宏備,許瑞勝

(1.欽州市動物疫病預防控制中心,廣西欽州 535000;2.廣西動物疫病預防控制中心,廣西南寧 530001;3.廣西大學動物科學技術學院,廣西南寧 530005)

豬腦心肌炎病毒GXLC株VP1基因的克隆與序列分析*

陳進喜1,施開創2*,屈素潔2,鄭 敏2,李向濤3,陳宏備3,許瑞勝3

(1.欽州市動物疫病預防控制中心,廣西欽州 535000;2.廣西動物疫病預防控制中心,廣西南寧 530001;3.廣西大學動物科學技術學院,廣西南寧 530005)

應用RT-PCR方法擴增豬腦心肌炎病毒GXLC株的VP1基因,擴增產物克隆入pMD 18-T載體后進行測序,對獲得的VP1基因序列進行分析。序列分析表明,GXLC株VP1基因長度為831 bp,編碼277 aa,含有2個潛在的N-糖基化基序和9個抗原表位。同源性分析表明,GXLC株與國內外其他26個EMCV分離株VP1基因核苷酸序列的同源性在78.6%～99.6%之間、氨基酸序列的同源性在95.1%～99.3%之間。遺傳進化分析表明,基于VP1基因序列繪制的系統進化樹可以將所有EMCV分離株分成兩個群,即Ⅰ群和Ⅱ群,Ⅰ群可再細分為Ⅰa亞群和Ⅰb亞群,其中豬源、鼠源EMCV在Ⅰ群和Ⅱ群中均有分布,人源EMCV則分布在Ⅱ群;GXLC株與其他中國分離株均屬于Ⅰa亞群。

豬;腦心肌炎病毒;VP1基因;分子特征

腦心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus,EMCV)屬于微RNA病毒科心病毒屬,可以感染多種家畜、野生動物和人類,鼠類是其自然貯存宿主。EMCV主要引起斷奶仔豬的腦炎、心肌炎、突然死亡及母豬的繁殖障礙。EMCV在病毒粒子形成過程中,其前體蛋白最終裂解為結構蛋白1A(VP4)、1B(VP2)、1C(VP3)、1D(VP1)和非結構蛋白 2A、2B、2C 、3A 、3B、3C 、3D。其中,結構蛋白 VP1 的抗原性最強,且與病毒粒子表面的拓撲結構、抗原性、受體吸附及脫殼有關[1-2]。VP1蛋白刺激小鼠產生的多克隆抗體具有中和活性,可以中和EMCV在小鼠體內的感染能力,表明VP1蛋白是 EMCV重要的保護性抗原[3-4]。VP1基因核苷酸突變導致所編碼氨基酸的變異可造成病毒血凝活性的喪失、病毒受體結合位點的改變,從而導致EMCV在致糖尿病型和非糖尿病型之間的轉變[5-6],表明VP1基因對EMCV的致病性發揮重要作用。本研究對EMCV GXLC株VP1基因進行克隆和分子特征分析,為進一步開展EMCV的致病和免疫機制研究提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒 EMCV GXLC株于2008年5月從廣西陸川縣某豬場一頭表現為急性心肌炎、經 realtime PCR檢測為EMCV陽性[7]的斷奶仔豬的心、脾組織中分離和鑒定,GenBank登錄號為FJ897755[8],由廣西動物疫病預防控制中心分離并保存。病毒在BHK-21細胞系上傳至第3代用于VP1基因序列測定。

1.1.2 主要試劑TaqDNA聚合酶、M-MLV反轉錄酶、HindⅢ和EcoRⅠ限制酶、膠回收試劑盒、pMD 18-T載體等購自寶生物工程(大連)有限公司;總RNA提取試劑盒、質粒DNA小量提取試劑盒購自杭州博日科技有限公司;E.coliDH5α感受態細胞購自天根生化科技(北京)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物 參考豬EMCV BJC3株(GenBank登錄號:DQ464062)基因序列,設計并合成覆蓋完整VP1基因的特異性引物 EMCV-VP1-F:5′-ACTCAAGATGCCTATCTCAC-3′和 EMCV-VP1-R:5′-CCAAAAT TGTCCATGTCTAAAC-3′,擴增預期大小為979 bp的基因片段。

1.2.2 病毒RNA的提取及RT-PCR 取細胞培養后的病毒上清液,按試劑盒操作說明提取總RNA。采用九聚體寡核苷酸引物為反轉錄引物,以總RNA為模板,用M-MLV反轉錄酶進行反轉錄,獲得cDNA。以cDNA為模板,應用特異性引物,進行PCR擴增 。25 μ L 反應體系:cDNA 模板 2.0 μ L,10 ×緩沖液 2.5 μ L,dNTP(2.5 mmol/μ L)2.0 μ L,TaqDNA 聚合酶(5 U/μ L)0.5 μ L,上、下游引物(25 pmol/μ L)各 0.5 μ L,ddH2O 17 μ L 。 反應參數:94℃5 min;94℃45 s,56℃45 s,72℃1 min,35個循環;72℃10 min。反應結束后,以15 g/L瓊脂糖凝膠電泳驗證擴增產物。

1.2.3 PCR擴增產物的克隆與VP1基因序列的測定 PCR擴增產物用瓊脂糖凝膠進行電泳后,采用膠回收試劑盒進行純化。純化的目的片段與pMD 18-T載體連接,轉化E.coliDH5α。經藍白斑篩選,挑出陽性克隆,增菌培養后,用質粒抽提試劑盒抽提質粒,進行酶切鑒定。測序由寶生物工程(大連)有限公司采用M13和M13RV通用引物進行雙向測序。利用DNA Star軟件包中的SeqMan程序和測序峰圖軟件Chromas2.22對測序結果進行拼接,獲得VP1基因序列。

1.2.4 VP1蛋白特性分析 運用DNA Star軟件包中的Protean程序對EMCV GXLC株VP1蛋白的親水性(Kyte-Doolittle法預測)、抗原指數(Jameson-Wolf法預測)、表面可能性(Emimi法預測)進行分析。

1.2.5 VP1基因同源性分析 運用DNA Star軟件包,對GXLC株及從NCBI GenBank下載的其他26株EMCV參考毒株(見表1)VP1基因的核苷酸序列及其推導的氨基酸序列進行同源性分析。

1.2.6 VP1基因系統進化分析 基于EMCV VP1基因的核苷酸序列,運用MEGA3.1軟件包中的Neighbor-joining方法,以Mengo-M分離株作為外類群(outgroup)繪制系統進化樹。

2 結果

2.1 EMCV VP1基因的PCR擴增及重組質粒鑒定

應用設計的引物進行PCR,得到與預期目的片段大小一致的擴增產物。產物經純化、連接到pMD 18-T載體、轉化到DH5α感受態細胞,獲得陽性克隆菌。經酶切鑒定和PCR鑒定,表明已成功獲得EMCV VP1基因的重組質粒(圖1)。

圖1 EMCV VP1基因的重組質粒鑒定Fig.1 Identification of the recombinant plasmid with VP1 gene of EMCV

2.2 EMCV VP1基因序列

對重組質粒中插入的VP1基因目的片段進行雙向測序和拼接后,獲得EMCV GXLC株VP1基因序列,全長為831 bp,編碼 277 aa(圖2)。

圖2 EMCV GXLC株VP1基因的核苷酸序列及其推導的氨基酸序列Fig.2 T he nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of VP1 gene of EMCV GXLC strain

2.3 VP1蛋白特性分析及其抗原表位預測

GXLC株的VP1蛋白由277 aa組成,有2個潛在的N-糖基化基序,分別為N29QT和N62QT。按照Kyte-Doolittle法的氨基酸親水性標準,VP1蛋白親水性較高的區域主要在0～17、25～36、37～42、75～113、147～ 158、164～ 175、202～ 212、239～ 249和259～268位氨基酸區段;根據 Emimi原則推測,VP1蛋白的 11～ 15、27～32、38～ 41、73～ 90、96～100、106 ～ 111、149～155、166～ 173、203 ～ 210 和239～245位氨基酸區段出現在蛋白質表面的可能性比較大,而且這些區段均位于VP1蛋白的親水區域;根據Jameson-Wolf法預測結果顯示,VP1蛋白大多數區域的抗原性指數都比較高,其中1～18、26～ 33、37～ 44、48～ 58、74～ 90、93～ 102、104～ 112、147～ 156、163 ～172、203～ 214、217～ 225、229～237、247～252和258～272位氨基酸區段的抗原指數最為顯著(圖3)。根據以上結果,預測 EMCV GXLC株VP1有9個抗原表位,分布在EPVP1-1(P27ENQTK)、EPVP1-2(Y37DRSS)、EPVP1-3(A80YDQLR PQRLT)、EPVP1-4(G96NEETS)、EPVP1-5(K107SKQDY)、EPVP1-6(T150PTKPT T)、EPVP1-7(G168RTPQV)、EPVPVP1-8(G204HKRFD)和EPVP1-9(Y242KNMRV)。

圖3 EMCV GXLC株VP1蛋白特性預測Fig.3 Prediction on antigen sites and some characters of VP1 protein of EMCV GXLC strain

2.4 VP1基因同源性分析

將GXLC株VP1基因的核苷酸序列及其推導的氨基酸序列與其它參考毒株進行同源性比較的結果見表1。GXLC株與國內外分離株VP1基因核苷酸序列的同源性在78.6%～99.6%之間、氨基酸序列的同源性在95.1%～99.3%之間。其中,GXLC株與GX0601、GX0602、BJC3、HB1等中國分離株的核苷酸同源性高達99.2%以上、氨基酸序列同源性在98.6%以上。值得注意的是,GXLC株與其他分離株VP1基因的核苷酸序列同源性最低僅為78.6%,而氨基酸序列同源性均在95.1%以上,說明部分核苷酸堿基的突變并未導致所編碼氨基酸的改變,屬于沉默突變。

2.5 VP1基因系統進化分析

基于EMCV VP1基因核苷酸序列繪制系統發育進化樹(圖4),EMCV可分為2個群:Ⅰ群和Ⅱ群,而I群又可以進一步細分為Ⅰa亞群和Ⅰb亞群。豬源、鼠源EMCV在Ⅰ群和Ⅱ群中均有分布,人源EMCV則分布在Ⅱ群。值得注意的是,來源于亞洲國家的EMCV分離株均分布在Ⅰa亞群,而Ⅱ群中的豬源分離株均來源于歐洲國家。GXLC株與中國其他分離株均屬于Ⅰa亞群。

表1 GXLC株與其他EMCV參考株VP1基因核苷酸及推導的氨基酸序列同源性比較Table 1 Homological comparison of the nucleotide and deduced amino acid sequences of VP1 gene of GXLC strain with other EM CV isolates

圖4 基于EMCV VP1基因核苷酸序列的系統進化樹Fig.4 Phylogenetic tree based on EMCV VP1 gene nucleotide sequences

3 討論

EMCV的中和表位主要存在于VP1、VP2和VP3,其中VP1是EMCV最重要的中和性抗原表位所在的區域[1,9]。原核表達的VP1蛋白經Western blot檢測證實具有抗原活性[10],以VP1蛋白免疫小鼠可以產生保護性中和抗體、提供針對EMCV的保護力[2-4],因此可以將VP1制備診斷抗原,同時VP1基因在設計基因工程疫苗時也有重要的應用價值。序列分析表明,EMCV GXLC株VP1基因長度為831 bp,編碼277 aa,預測存在9個抗原表位,分布在27～ 32、37～ 41、80～ 90、96～ 101、107～ 112、150～156、168～173、204～209和 242～247位氨基酸區段。對于這些抗原表位的預測,可以利用噬菌體展示技術等方法加以證實。

同源性比較表明,不同來源的EMCV分離株多以結構蛋白VP1變異最大[8],同時VP1是 EMCV最重要的中和性抗原表位所在的區域[1],因此VP1成為EMCV研究的重點。本研究中,GXLC株與其他分離株VP1基因核苷酸序列的同源性在78.6%～99.6%之間,變異較大,提示 EMCV結構蛋白VP1作為病毒主要中和表位所在的區域,受到選擇壓力的影響,VP1基因不斷發生變異以維持EMCV的存活。同時,VP1氨基酸序列的同源性在95.1%～99.3%之間,提示在選擇壓力下多數核苷酸的變異屬于沉默變異,并沒有導致相應氨基酸的改變,VP1的結構和功能仍得以保持。由于VP1是EMCV最重要的中和性抗原表位所在區域,也是基因序列變異較大的區域,對VP1的分析能使我們對EMCV的致病性及遺傳變異有更好的了解,因此VP1基因成為開展EMCV分子流行病學研究的重點區域[11-12]。

基于VP1基因序列的系統發育進化樹,可將所有EMCV分離株區分為Ⅰ群和Ⅱ群,豬源、鼠源EMCV在兩個群中均有分布,并且親緣關系很近,所以鼠類傳播EMCV的作用不容忽視。有研究發現,鼠類是豬腦心肌炎暴發流行風險因子中的關鍵因素[13],發病豬場內及周邊的老鼠體內可以檢測出EMCV,而老鼠本身不表現任何異常癥狀,僅是作為EMCV貯存庫存在[14-15]。因此,搞好豬場內及周邊的滅鼠工作對有效防控豬腦心肌炎至關重要。最近,Oberste M S等[16]報道從秘魯兩名表現惡心、頭痛和呼吸困難的病人血清中分離到EMCV,對病毒VP1基因90%的序列進行分析,發現與豬源EMCV分離株的同源性高達91.7%～99.9%。本研究中,2株人源 EMCV分離株(Peru-2004/10854、Peru-2004/10855株)在進化樹中屬于Ⅱ群,與同群的豬源、鼠源EMCV分離株親緣關系很近,因此,人、豬、禽在EMCV感染與傳播中的相互關系令人矚目。但是,由于人源EMCV分離株及其基因序列的信息極少,要準確分析腦心肌炎暴發流行中人、豬、禽的作用及相互關系,還有待于EMCV分子流行病學和分子生態學研究的進一步積累。

不同EMCV分離株其致病性有所差異[17]。研究表明,VP1基因與病毒致病性密切相關[11]。Nelsen-Salz B等[5]發現致糖尿病(PV2株)與非致糖尿病(PV7株)EMCV變異株的差異僅僅是VP1第63位氨基酸殘基發生突變(Gln→Glu)。Denis P等[18]報道,引起仔豬心肌炎的一株病毒(BEL-279/95株)在BHK-21細胞系中傳210代后,對仔豬的致病性減弱,其VP1第62位氨基酸殘基發生突變(Asn→Asp)。Guy M 等[19]將EMCV 1086C株在大鼠BRL細胞傳代29代后,病毒適應了細胞,產生高滴度的病毒和明顯的細胞病變,進一步研究發現是VP1第49位氨基酸殘基發生了突變(Lys→Glu),使病毒獲得與細胞表面受體唾液酸殘基結合的能力。而上述VP1第49、62、63位氨基酸殘基均位于 EMCV第4個中和表位,并且處在連接VP1 βB和βC鏈的連接環的表面從而易于與細胞受體結合,提示EMCV對應于第4個中和表位的區域與細胞表面受體、病毒致病性有關[19]。可見,VP1與受體結合、病毒中和及病毒毒力之間具有密切聯系。因此,研究EMCV毒株VP1基因的分子特征,有助于分析分離株的毒力與致病作用。GXLC株與國內外其他EMCV分離株VP1氨基酸序列的同源性在95.1%～99.3%之間,與 PV2株、BEL-279/95株、1086C 株分別有5、4、4個氨基酸的差異。目前,GXLC株對豬、鼠的致病性研究正在進行之中。

[1]Racaniello V R.Picornaviridae:The viruses and their replication,in Knipe D M,Howley P M,Griffin D E,et al.Fields Virology[M].4th Edition.Lippincott Williams&Wilkins Publishers,2001:685-715.

[2]M orishima T,Mcclintock P R,Aulakh G S,et al.Genomic and receptor attachment differences between Meng ovirus and encephalomyocarditis virus[J].Virology,1982,122(2):461-465.

[3]Sin J I,Sung J H,Suh Y S,et al.Protective immunity against heterologous challenge with encephalomyocarditis virus by VP1 DNA vaccination:effect of coinjection with a granulocy te-macrophage colony stimulating factor gene[J].Vaccine,1997,15(17-18):1827-1833.

[4]Suh Y S,Ha S J,Lee C H,et al.Enhancement of VP1-specific immune response and protection against EM CV-K challenge by co-delivery of IL-12 DNA with VP1 DNA vaccine[J].Vaccine,2001,19(15-16):1891-1898.

[5]Nelsen-Salz B,Zimmermann A,Wickert S,et al.Analysis of sequence and pathogenic properties of two variants of encepha-lomy ocarditis virus differing in a single amino acid in VP1[J].Virus Res,1996,41(2):109-122.

[6]Bae Y S,Eun H M,Yoon J W.Genomic differences between the diabetogenic and non-diabetogenic variants of encephalomyocarditis virus[J].Virology,1989,170(1):282-287.

[7]施開創,陳進喜,屈素潔,等.豬腦心肌炎病毒SYBR Green I real-time PCR檢測方法的建立[J].中國獸醫科學,2009,39(2):135-139.

[8]施開創,屈素潔,陳進喜,等.豬源腦心肌炎病毒GXLC株全基因組序列測定與分析[J].病毒學報,2010,26(2):134-142.

[9]Koenen F,Vanderhallen H,Papadopoulos O,et al.Comparison of the pathogenic,antigenic and molecular characteristics of two encephalomyocarditis virus(EMCV)isolates from Belgium and Greece[J].Res Vet Sci,1997,62(3):239-244.

[10]蓋新娜,楊漢春,郭 鑫,等.豬腦心肌炎病毒結構蛋白VP1基因的克隆與原核表達[J].中國獸醫雜志,2006,42(11):9-11.

[11]Koenen F,Vanderhallen H,Castryck F,et al.Epidemiologic,pathogenic and molecular analysis of recent encephalomyocarditis outbreaks in Belgium[J].Zentralbl Vet Med B,1999,46(4):217-231.

[12]An D J,Jeong W,Jeoung H Y,et al.Encephalomy ocarditis in Korea:serological survey in pigs and phylogenetic analysis of two historical isolates[J].Vet Microbiol,2009,137(1-2):37-44.

[13]M aurice H,Nielen M,Vyt P,et al.Factors related to the incidence of clinical encephalomyocarditis virus(EMCV)infection on Belgian pig farms[J].Pre Vet Med,2007,78(1):24-34.

[14]Kluivers M,Maurice H,Vyt P,et al.T ransmission of encephalomyocarditis virus in pigs estimated from field data in Belgium by means of R0[J].Vet Res,2006,37(6):757-766.

[15]Billinis C.Encephalomyocarditis virus infection in wildlife species in Greece[J].J Wildl Dis,2009,45(2):522-526.

[16]Oberste M S,Gotuzzo E,Blair P,et al.Human febrile illness caused by encephalomy ocarditis virus infection,Peru[J].Emerg Infect Dis,2009,15(4):640-646.

[17]Kim H S,Christianson W T,Joo H S.Pathogenic properties of encephalomyocarditis virus isolates in swine fetuses[J].A rch Virol,1989,109(1-2):51-57

[18]Denis P,Koenen F.M olecular analy sis of the capsid coding region of a virulent encephalomyocarditis virus isolate after serial cell passages and assessment of its virulence[J].Arch Virol,2003,148(5):903-912.

[19]Guy M,Chilmonczyk S,Crucire C,et al.Efficient infection of buffalo rat liver-resistant cells by encephalomyocarditis virus requires binding to cell surface sialic acids[J].J Gen Virol,2009,90(1):187-196.

Cloning and Sequence Analysis of VP1 Gene of Encephalomyocarditis Virus GXLC Strain Isolated from Swine

CHEN Jin-xi1,SHI Kai-chuang2,QU Su-jie2,ZHENG Min2,LI Xiang-tao3,CHEN Hong-bei3,XU Rui-sheng3

(1.Qinzhou Center for Animal Disease Control and Prevention,Qinzhou,Guangxi,535000,China;2.Guangxi Center for Animal Disease Control and Prevention,Nanning,Guangxi,530001,China;3.College of Animal Science and Technology,Guangxi University,Nanning,Guangxi,530005,China)

T he structural protein VP1 gene of encephalomyocarditis virus(EMCV)GXLC strain was amplified by RT-PCR,cloned into a pMD 18-T vector,sequenced and analyzed.The sequence analysis showed that the VP1 gene of GXLC strain consisted of 831 nucleotides encoding 277 amino acides and contained 2 potential N-glycosylation motifs and 9 epitopes.The homology analysis indicated the homology of GXLC strain and other EMCV strains available in GenBank were from 78.6%-99.6%and from 95.1%-99.3%based on the nucleotide and deduced amino acide sequences,respectively.The phylogenetic tree based on the VP1 gene sequences revealed that all the EMCV strains could be divided into two groups:groupⅠand groupⅡ,and groupⅠcould be subdivided into subgroupⅠa and subgroupⅠb.The strains from pig and mouse distributed in groupⅠand groupⅡ,while the strains from human distributed in groupⅡ.GXLC strain,together with other EMCV isolates from China,belonged to subgroupⅠa.

swine;Encephalomyocarditis virus;VP1 gene;molecular characteristic

S852.659.6;Q786

A

1007-5038(2010)08-0045-06

2010-05-25

廣西科學基金項目(桂科青0728047);廣西科技創新能力與條件建設基金項目(08-05-01D)

陳進喜(1983-),男,福建云霄人,助理獸醫師,碩士,主要從事動物疫病診斷與防控技術研究。*通訊作者