胎衣不下奶牛胎兒胎盤中IL-2含量的測定

馬清河,劉榮欣,陳 斌,王士哲,李海燕,姜國均*

(1.河北農業大學中獸醫學院,河北定州 073000;2.河北省定州市農牧局,河北定州 073000)

胎衣不下奶牛胎兒胎盤中IL-2含量的測定

馬清河1,劉榮欣1,陳 斌1,王士哲2,李海燕2,姜國均1*

(1.河北農業大學中獸醫學院,河北定州 073000;2.河北省定州市農牧局,河北定州 073000)

通過對胎盤組織中IL-2的含量檢測,探討奶牛發生胎衣不下的免疫學機制。將20頭奶牛分為健康對照組和胎衣不下組,采集健康奶牛和胎衣不下奶牛的胎兒胎盤,制備胎盤組織勻漿液,用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測其中的IL-2的含量。結果表明,胎衣不下組奶牛胎盤組織中IL-2的含量極顯著高于健康組(P＜0.01),說明胎盤組織中IL-2含量與奶牛發生胎衣不下有密切關系。

胎衣不下;胎盤;IL-2;奶牛

胎衣不下(Placenta retention)又稱胎衣滯留、息胞。母牛分娩后,經過12 h胎衣還未全部排出,即為胎衣不下。胎衣不下是奶牛常見的產科疾病之一,發病率高達10%～25%[1]。據河北、北京等有關單位統計,在炎熱季節部分奶牛場奶牛胎衣不下發病率在70%以上,其中88%繼發感染子宮內膜炎,繼而發生不孕和產奶量下降,并容易出現乳房炎,嚴重影響奶牛的生產性能[2]。

白細胞介素2(IL-2)主要由 T細胞及胎盤滋養層細胞產生,具有促進妊娠和破壞妊娠雙重作用。研究表明[3],IL-2主要參與子宮黏膜免疫排斥反應,不利于妊娠的維持。流產模型母鼠懷孕時母胎界面表達 IL-2 mRNA,并產生 IL-2、IFN-γ和 TNF-α,而正常鼠無此現象。給正常懷孕小鼠注射IL-2后可引起附植障礙,并導致流產或流產率提高。但是,適量的IL-2是胚胎發育所必需的。懷孕早期滋養層細胞能表達IL-2 mRNA,而IL-2一方面能刺激蛻膜T細胞產生粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte macrophage-colony stimulating factor,GMCSF),促進滋養層細胞的生長發育,另一方面能激活γ-δ T 細胞,從而分泌 TGF-β1,維持妊娠期的免疫抑制作用。另有研究表明,褪黑激素(MLT)可能刺激T H-2型細胞釋放IL-2,刺激樹突細胞(dendritic cell,DC)釋放IL-12,從而保持依賴TH-1型細胞因子的細胞免疫功能。

胎盤是尿膜絨毛膜及子宮黏膜發生聯系所形成的結構。胎盤雖然是一個暫時性器官,但在妊娠過程中起著重要作用,它可通過屏障作用有效的執行物質交換、新陳代謝及內分泌和免疫等重要功能。胎盤組織中大量免疫細胞因子,它們直接或間接的參與胎盤的代謝,在胎盤的發育和排出過程中具有重要作用。研究表明,胎衣不下與血液流變學、血液中激素水平等都有密切的關系[4-5],但與胎盤組織局部免疫細胞因子水平相關性的研究少見報道。本試驗旨在通過檢測胎衣不下奶牛和正常奶牛胎盤組織IL-2含量的差異,探索胎衣不下發生的免疫學機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗用動物 試驗用奶牛由河北農業大學附屬奶牛場提供,胎次在1胎～4胎,供試牛均在正常飼養條件下飼養。

1.1.2 試劑和儀器 IL-2酶聯免疫分析試劑盒,美國ADL公司生產;680型酶標儀由美國Bio-Rad公司生產;MIKRO 22R臺式冷凍離心機由德國Hettich公司生產。

1.2 方法

1.2.1 試驗分組 按年齡、胎次、體質狀況和分娩期接近的原則,選用胎衣不下奶牛和產后健康奶牛各10頭,設為胎衣不下組和健康組。

健康奶牛標準為:營養中等以上,產程順利,自然分娩,產后胎衣在12 h內排出,產前產后均無合并癥、并發癥,犢牛健康。

奶牛胎衣不下標準:自然分娩,胎衣在產后12 h內不能排出或不能完全排出。

1.2.2 樣品的采集和處理

1.2.2.1 健康組奶牛 選取胎兒胎盤上的子葉作為試驗材料。在自然狀態下,胎衣完全從奶牛子宮脫離時,迅速采集最后脫離子宮的新鮮干凈子葉,用標準封口袋密封,編號后置-20℃冰箱中冷凍保存。

1.2.2.2 胎衣不下組奶牛 在確診奶牛發生胎衣不下后,實施外科手術剝離滯留在子宮內的胎衣。選取剝離的新鮮子葉用標準封口袋密封,編號后置-20℃冰箱中冷凍保存。

1.2.3 檢測項目

1.2.3.1 對奶牛主要臨床指標的觀察 觀察奶牛胎衣不下的發生率和子宮內膜炎的發病率,記錄胎衣排出時間、惡露排盡時間、首次發情時間、受孕時間和產奶量等。

1.2.3.2 胎盤組織中IL-2的檢測 采用酶聯免疫吸附法進行檢測。將冷凍保存的子葉放入液氮中,1 h后取出,在研缽中充分研磨成勻漿。取5 mL勻漿在低溫冷凍離心機中以10 000 r/min離心3 min,取上清液按照IL-2酶聯免疫分析試劑盒說明書進行操作。于波長450 nm的酶標儀上讀取各孔的OD值。

1.2.4 數據處理 根據試劑盒提供的標準品繪制標準曲線及方程,計算各樣品中IL-2的含量。試驗數據使用Excel 2000軟件,采用t檢驗進行統計分析。

2 結果

2.1 奶牛主要臨床指標的觀察結果

健康對照組10頭奶牛分娩后惡露排出形狀和時間正常,均在產后90 d(3個發情期)內受孕,受孕率100%;胎衣不下組有3頭奶牛在產后90 d內受孕,其余7頭中有6頭發生明顯子宮炎,后雖用抗生素進行治療,但在產后90 d內未受孕,另有一頭沒有發現明顯子宮炎癥,但在產后90 d內也未受孕,疑似隱形生殖系統炎癥。胎衣不下組的總受孕率為30%,極顯著低于健康對照組(P＜0.01)。結果見表1。

表1 奶牛產后主要臨床指標觀察結果Table 1 The observation results of clinical manifestation in post partum cows

2.2 胎盤組織中IL-2的含量變化

胎衣不下組奶牛胎盤組織中IL-2的含量高于于健康對照組,差異極顯著(P＜0.01)。試驗表明,胎盤組織中IL-2含量的降低與奶牛胎衣不下的發生關系密切(表2)。

表2 奶牛胎盤組織中IL-2的含量變化Table 2 The change of level of IL-2 in the placenta of cows pg/mL

3 討論

胎衣不下的發生,從生理學上來說是母體胎盤和胎兒胎盤吻合部出現炎癥反應及粘連。從免疫學上來說,Th1型細胞因子主要介導細胞免疫及局部炎癥反應,特別是導致局部炎性反應[6],非常不利于胎衣排出,所以Th1型細胞因子作為促炎因子對胎盤間發生炎癥反應及黏連癥狀起著很關鍵的作用。

胎兒胎盤除了滋養胎兒的作用外,同時也是一種功能復雜的免疫器官。其中含有豐富免疫職能細胞,主要有自然殺傷細胞、巨噬細胞及T細胞,它們分泌多種細胞因子,各種細胞因子間相互作用,構成母胎界面免疫微環境的復雜細胞因子網絡[7]。根據輔助性T細胞(T helper cell,Th)分泌細胞因子的不同優勢效應,將其分為Th1和 Th2型,Th1型以分泌白介素-2(IL-2)、干擾素-γ(IFN-γ)、TNF-α等細胞因子為主,Th2型細胞以分泌IL-4、IL-5、IL-10等細胞因子為主。胎盤滋養層細胞、蛻膜細胞及單核巨噬細胞能分泌上述多種細胞因子[8]。在正常情況下,需要母體生殖系統中Th1/Th2細胞因子相互協調才能順利的發動分娩、將胎兒娩出及胎衣排出。整個產程就是胎盤絨毛膜的滋養層細胞和基質細胞凋亡萎縮的過程[9],當這兩類細胞因子失去平衡時,就會導致細胞凋亡速度的增加或減緩,使產程出現問題,發生胎衣不下。

IL-2主要由T細胞及胎盤滋養層細胞產生,具有促進妊娠和破壞妊娠雙重作用。試驗發現[3],IL-2主要參與子宮黏膜免疫排斥反應,不利于妊娠的維持。啟動分娩時,IL-2含量會增加,但IL-2過度增高或當胎兒娩出后IL-2含量高于正常水平的話,則容易發生母子胎盤界面間炎性反應,導致胎衣不下。另外,子宮中IL-2含量過高會引起早產或流產,此類母牛更容易發生胎衣不下,這也說明IL-2含量過高是導致胎衣不下的主要細胞因子。本次試驗中胎衣不下組 IL-2含量極顯著高于健康對照組,說明IL-2是引發胎衣不下的主要細胞因子。

營養缺乏、感染、應激或遺傳因素均可導致Th1型細胞因子分泌增加,引起胎盤滋養層細胞凋亡率增高,導致胎盤組織激素合成能力降低[8]。由于雌激素相當一部分是胎盤組織分泌的,所以雌激素的合成分泌必然降低。大量試驗表明,胎衣不下的奶牛血液中雌激素含量顯著低于正常奶牛,這可以證明上述推論成立[10]。又有研究表明雌激素能夠有效抑制胎盤組織Th1型細胞因子的產生[11]。也就是說Th1型細胞因子分泌增加導致胎盤組織中雌激素合成分泌降低,而雌激素合成分泌降低又減少了對Th1型細胞因子分泌的抑制,最終通過這種反饋效應促使胎盤組織炎性反應加重,進而阻礙胎衣正常排出。

IL-2、TNF-α和IFN-γ在體內還可促進局部血管內凝血的發生,凝血后可造成局部血液循環障礙,內皮細胞出現缺血、缺氧性損傷,血管壁通透性增加,在體內導致血管內皮細胞損傷[12]。當過量產生Th1型細胞因子就會引發和加重母體胎盤和胎兒胎盤吻合部的炎性反應和黏連癥狀,阻礙胎兒絨毛與母體胎盤的隱窩樣凹陷分離。此次試驗表明,胎衣不下組IL-2含量極顯著高于健康組(P＜0.01),胎衣不下組IL-2平均濃度(16.68pg/mL±1.36 pg/mL)達到健康對照組(8.08 pg/mL±0.39 pg/mL)的兩倍,其比值為2.06∶1,可見胎盤組織中IL-2含量劇烈升高是導致發生胎衣不下的主要影響因素。

胎衣不下的發生,從生理學上來說是母體胎盤和胎兒胎盤吻合部出現炎癥反應及粘連;從免疫學上來看,Th1細胞因子主要介導細胞免疫及局部炎癥反應,特別是導致局部炎性反應,非常不利于胎衣排出,Th1型細胞因子作為促炎因子對胎盤間發生炎癥反應及粘連癥狀起著很關鍵的作用。本次試驗表明,胎盤組織中IL-2的含量升高是引發胎衣不下的重要機理之一。

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Detection of Levelsin of IL-2 in the Placenta of Cows with Placenta Retention

MA Qing-he1,LIU Rong-xin1,CHEN Bin1,WANG Shi-zhe2,LI Hai-yan2,JIANG Guo-jun1

(1.College of Traditional Chinese Veterinary Medicine,Hebei Agricultural University,Dingzhou,Hebei,073000,China;2.Agricultural and Animal Husbandry Bureau of Dingzhou County,Dingzhou,Hebei,073000,China)

To investigate the fluctuating regulation of placenta IL-2 levels in cow s with placenta retention,and study the immune mechanisms of placenta retention,twenty cows were divided into two groups,and the foetal placenta of cows were collected.Then the contents of IL-2 in foetal placenta supernatant were measured by ELISA.The results showed that the level of IL-2 in placenta retention group was significantly higher than that in control group(P＜0.01).The results demonstrated that the higher level of IL-2 of placenta retention was one of the important reasons that caused the placenta retention in cow s.

placenta retention;placenta;IL-2;cow

S857.23

A

1007-5038(2010)08-0041-04

2010-02-06

資金項目:河北省畜牧獸醫局科技項目(200606)

馬清河(1971-),男,寧夏固原人,講師,碩士,主要從事中藥防治畜禽疾病學研究。*通訊作者