銅綠假單胞菌抗體制備及抑菌作用*

陳 煜,楊燕凌,謝小芳,肖西志

(1.福建農林科技大學生命科學學院,福建福州 350002;2.山東出入境檢驗檢疫局,山東青島 266002;3.西北農林科技大學動物醫學院,陜西楊陵 712100)

銅綠假單胞菌抗體制備及抑菌作用*

陳 煜1,楊燕凌1,謝小芳1,肖西志2,3*

(1.福建農林科技大學生命科學學院,福建福州 350002;2.山東出入境檢驗檢疫局,山東青島 266002;3.西北農林科技大學動物醫學院,陜西楊陵 712100)

研究銅綠假單胞菌抗體對銅綠假單胞菌生長的抑制作用。制備兔抗銅綠假單胞菌抗體,純化后加入液體和固體培養基中,接種沙門菌和銅綠假單胞菌混合物,對沙門菌進行選擇分離。試驗表明,添加抗體后能夠成功抑制銅綠假單胞菌的生長,而不影響沙門菌的分離。將200 μ L和400 μ L銅綠假單胞菌抗體添加入相應培養基中,能夠抑制銅綠假單胞菌的生長,而達到篩選沙門菌的目的。

銅綠假單胞菌;抗體;培養基;抑菌作用

銅綠假單胞菌形態為直或稍彎、兩端鈍圓的桿菌,革蘭氏染色陰性,專性需氧。在自然界分布廣泛,為土壤中存在的最常見的細菌之一,也是臨床上的機會性致病菌之一。各種水、空氣、正常人的皮膚、呼吸道和腸道等都有本菌存在。本菌最適生長溫度35℃,在41℃也能生長。雖然在動物性飼料檢測項目中不包括銅綠假單胞菌,但它的存在會對沙門菌的檢測造成干擾,特別是在一些顯色培養基中,銅綠假單胞菌與沙門菌表現出同樣的菌落顏色。因此,研究能抑制銅綠假單胞菌檢出的培養基將有助于沙門菌的檢測和鑒定,減少工作量。將抗體添加到培養基中研究其體外抗菌作用是臨床細菌性疾病的免疫治療的方法之一[1-2],同時也應用于抑制口腔中變形桿菌的黏附[3-4]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 銅綠假單胞菌由山東出入境檢驗檢疫局技術中心農產品檢測中心分離并保存;鼠傷寒沙門菌(IQCC10503)由中國檢驗檢疫科學院食品所饋贈;陰溝腸桿菌為本實驗室分離并保存。

1.1.2 試驗用動物 新西蘭大白兔購自青島市食品藥品監察所。

1.1.3 主要試劑和儀器 VITEK GN鑒定卡,為法國梅里埃公司產品;亞烯酸鹽胱氨酸肉湯(SC)、氯化鎂孔雀綠肉湯(MM)北京陸橋公司產品;營養瓊脂,均為OXOID公司產品;硫酸銨,為國藥集團化學試劑有限公司產品;PICODROP分光光度計(型號:PICOPET01),VITEK微生物鑒定系統。

1.2 方法

1.2.1 免疫原的制備 將銅綠假單胞菌接種營養瓊脂平板,37℃,24 h,刮取培養物,溶于生理鹽水中,充分溶解后分裝到滅菌小試管內,每管5 mL,分裝 4管。分別加入甲醛溶液 5、10、20、40 μ L,37 ℃下作用1 h后,分別接種營養瓊脂平板,檢測滅活效果。取無細菌生長的最小稀釋度作為免疫原。

1.2.2 免疫原蛋白含量的檢測 將制備的免疫原吸取2 μ L在PICODROP分光光度計上進行蛋白含量檢測。

1.2.3 免疫接種 用滅活的免疫原接種4只新西蘭大白兔,于初免后14 d進行二免,二免后30 d后加強免疫。加強免疫后1周內采血,分離血清,AGD法測抗體效價。

1.2.4 抗體純化 采用飽和硫酸銨法對分離的兔血清進行純化,具體操作按文獻[5]進行。

1.2.5 抑菌試驗的抗體用量的確定 分別取純化的抗體 25、50、100、200 μ L 接種于滅菌的10 mL營養肉湯中,然后往營養肉湯中加入100 μ L銅綠假單胞菌菌液100 μ L(1×109cfu),37 ℃培養24 h。用培養的營養肉湯接種營養瓊脂平板,37℃培養24 h。

1.2.6 液體培養基中的抑菌試驗 分別取100、200、400、800、1 600 μ L 的 1.2.5 中確定的抗體用量加入到5瓶滅菌的SC培養基中(100 mL),另外2瓶SC作為對照,即只接種1×109cfu的銅綠假單胞菌菌液,37℃,24 h后接種營養瓊脂和沙門菌顯色培養基;分別取 100、200、400 μ L 的 1.2.5 中確定的稀釋度抗體加入到滅菌的裝有MM的試管中(10 mL),另外2管作為對照,即只接種 100 μ L 1×109cfu的銅綠假單胞菌菌液,然后再加入 100 μ L 1×109cfu的銅綠假單胞菌菌液,42℃,24 h后接種營養瓊脂和沙門菌顯色培養基[6]。

1.2.7 固體培養基中的抑菌試驗 取100、200、400、800、1 600 μ L銅綠假單胞菌抗體與沙門菌顯色培養基(50℃～60℃)混合,然后倒平板,接種銅綠假單胞菌,設置2個對照,即不加抗體的銅綠假單胞菌菌液直接接種沙門菌顯色培養基,37℃,24 h后觀察結果。

1.2.8 沙門菌的選擇分離 取100 μ L銅綠假單胞菌抗體與100 μ L銅綠假單胞菌,然后將沙門菌菌液100 μ L同上述的混合液一起接種SC和MM,24 h后,將培養物接種沙門菌顯色培養基,37℃,12 h～24 h;將陰溝腸桿菌作為對照,接種于含有銅綠假單胞菌和抗體的培養基中。將分離的菌落進行純培養后用VITEK鑒定系統鑒定。

1.2.9 VITEK鑒定 將1.2.8中的分離的單菌落純培養后用VITEK GN(革蘭陰性鑒定卡)鑒定。

1.2.10 模擬試驗 將銅綠假單胞菌和沙門菌分別摻到經高壓滅菌的魚飼料、牛肉骨粉中,放入干燥箱中,37℃干燥。干燥后取25 g接種BPW(緩沖蛋白胨水),37℃,24 h。增菌后接種于含有銅綠假單胞菌抗體的SC和MM培養基中,抗體接種量為50、100、200、400 μ L。 SC,37 ℃,24 h;MM,42 ℃,24 h[7]。然后將SC、MM 的增菌液接種沙門菌顯色培養基,37℃,12 h～24 h。將分離的單菌落純培養后,用VITEK鑒定儀鑒定。

2 結果

2.1 免疫原的制備

經無菌檢測,向銅綠假單胞菌菌液中加甲醛至20 μ L時 ,無細菌生長。

2.2 免疫原的檢測

滅活的銅綠假單胞菌菌液經PICODROP分光光度計檢測,含量為10.65 mg/mL。

2.3 抗體效價測定

使用AGD法,所分離的血清效價為1∶64。按文獻[5]方法,用飽和硫酸銨法純化抗體。

2.4 抗體用量的確定

接種營養肉湯,37℃,24 h后,抗體接種為100 μ L和 200 μ L 時 ,營養肉湯中明顯有白色沉淀,培養液清亮;而接種抗體 25 μ L和50 μ L 的營養肉湯試管內培養液為渾濁。將上述培養液接種營養瓊脂平板后 ,接種 25 μ L 和 50 μ L 抗體的營養肉湯有細菌生長,而接種為100 μ L 和 200 μ L 抗體的營養肉湯培養物無菌落生長,結果見表1。

表1 接種營養肉湯后銅綠假單胞菌抗體用量Table 1 Confirmation of the P.Aeruginosa antibody doses in broth after inoculating P.aerugilnosa

2.5 液體培養基的抑菌試驗

當抗體接種量為1 600 μ L時,SC培養基中不能分離到銅綠假單胞菌菌;當抗體接種量為100 μ L時,MM培養基中不能分離到銅綠假單胞菌。

2.6 固體培養基的抑菌試驗

對照組生長出紫色菌落,試驗組中全部有紫色菌落,但菌落數比對照組少,結果見表2。

表2 銅綠假單胞菌抗體與沙門菌固體培養基的抑菌試驗Table 2 Antibacterial assay of P.aeruginosa antibody and S.salmonella solid media

2.7 沙門菌選擇分離

1.2.8中沙門菌顯色培養基上長出紫色菌落。純培養物用VITEK GN鑒定卡進行鑒定,表明實驗組中分離的細菌經鑒定為沙門菌,對照組為陰溝腸桿菌。

2.8 模擬試驗結果

經VITEK 鑒定,50 μ L 和100 μ L 抗體接種的平板長出沙門菌和銅綠假單胞菌,而接種200 μ L,400 μ L抗體的的只有沙門菌生長,結果見表3。

表3模擬試驗Table 3 Mimicry assay

3 討論

為了提高培養基的選擇性,目前有以下幾種方法:①在培養基中添加抗生素,該方案應用于基因工程中重組子的篩選,如在 LB培養基中加入卡那霉素,可以將插入了外源基因的大腸埃希菌篩選出來;②在培養基中添加呋喃類抑菌物質[8];③喹諾酮類[9];④小分子肽[10];⑤利用酶催化反應,在培養基中加入酶的底物,產這種酶的細菌將在培養基中顯示相應的顏色,這也是當前顯色培養基生產所采用的方法。目前,還沒有將相應抗體加入培養基來提高培養基選擇性的研究。

沙門菌是進出口動物性飼料的法檢項目之一,通常存在于未經加熱處理的牛羊肉骨粉中,而白魚粉、紅魚粉等經過熱處理的飼料中沙門菌較少。但存在于其中的腸桿菌科其他細菌在沙門菌的檢測中常能引起干擾,給沙門菌的分離、鑒定工作帶來很大麻煩。目前沙門菌的檢測首先是用BPW進行預增菌,然后經SC和MM 進行選擇性增菌,最后經選擇性培養基進行分離。為了加快沙門菌的分離,一些公司利用沙門菌的特異酶開發了沙門菌的顯色培養基,通過所分離細菌的菌落顏色來判斷是否為沙門菌。但通過大量的檢測發現,這些培養基對沙門菌的分離并不具有特異性,一些細菌的菌落與沙門菌的菌落顏色相同,即也為紫色,銅綠假單胞菌菌即為其中之一。為了提高培養基的選擇性,加快沙門菌的分離鑒定,我們通過向培養基中添加銅綠假單胞菌的抗體,來實現抑制銅綠假單胞菌的生長,從而排除沙門菌分離過程中銅綠假單胞菌造成的干擾。

本研究結果顯示,在液體培養基中添加銅綠假單胞菌的抗體能夠抑制該菌的生長,而且不影響沙門菌的分離。但在固體培養基中的效果卻不如液體培養基效果好,并不能完全抑制銅綠假單胞菌的生長,當添加抗體量較大時才會稍出現輕微的抑制,估計這與抗體作用的發揮主要是在液體環境中有關,另外一個原因可能是菌體在固體培養基表面生長,存在于培養基中的抗體與菌體的結合沒有液體中那樣充分,也就不能發揮其抑菌作用。

雖然沙門菌的鑒定方法很多,如PCR方法,這些方法具有快速、成本低等有點,但沙門菌檢測方法的“金標準”仍是細菌分離、鑒定,盡管細菌的分離鑒定工作耗時長、成本高,但通過兩步增菌能夠使存在于檢測樣品中的沙門菌大量增加,為后面的鑒定提供了足夠數量的“模版”。

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Antibody Preparation ofP.aeruginosaand Research on Antibacterial Effect

CHEN Yu1,YANG Yan-ling1,XIE Xiao-fang1,XIAO Xi-zhi2,3

(1.College of Li fe Science,Fujian Agriculture and Forestry University,Fuzhou,Fujian,350002,China;2.Shandong Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau,Qingdao,Shandong,266002,China;3.College of Veterinary Medicine,Northwest A&F University,Yangling,Shaanxi,712100,China)

To investigate the growth inhibition ofP.aeruginosathrough adding its antibody into media and accomplish the screening ofS.salmonella.The antibody ofP.aeruginosawere prepared and added into liquid and solid media after purification.S.salmonellaandP.aeruginosawere inoculated into the media and the cultures were evaluated.The growth ofP.aeruginosawas inhibited when its antibody was added into media,whereas the growth ofS.salmonellawas not.The growth ofP.aeruginosawas inhibited when its antibody was added into media and resulted in the screening ofS.salmonella.

P.aeruginosa;antibody;antibacterial effect;medium

S852.614

A

1007-5038(2010)08-0038-04

2009-12-25

山東出入境檢驗檢疫局科技項目(SK200809)

陳 煜(1977-),女,四川瀘州人,講師,主要從事分子生物學的教學和科研工作。*通訊作者