DMEM培養結腸小袋蟲的正交試驗*

閆文朝,王天奇,丁 軻,張 玲,韓利方,王新彩

(1.河南科技大學動物科技學院,河南洛陽 471003;2.河南科技大學醫學院,河南洛陽 471003)

DMEM培養結腸小袋蟲的正交試驗*

閆文朝1,王天奇1,丁 軻1,張 玲1,韓利方1,王新彩2

(1.河南科技大學動物科技學院,河南洛陽 471003;2.河南科技大學醫學院,河南洛陽 471003)

利用L9(34)正交試驗設計,研究了淀粉量、小牛血清比例和培養基初始pH 3個因素對結腸小袋蟲在DMEM培養基中所獲得的最高種群密度的影響。方差分析表明,初始pH影響最大,其次為淀粉量,血清比例影響最小。最佳培養基組成為淀粉40 mg/安瓿、血清150 mL/L(DMEM培養液2.55 mL+0.45 mL小牛血清),最適宜的DMEM培養基初始pH為7.0。

結腸小袋蟲;正交試驗設計;DMEM培養基

結腸小袋蟲(Balantidium coli)是一種重要的人畜共患寄生蟲,呈世界性分布,可感染人及豬、牛、鼠類、非人靈長類動物等33種動物[1-2]。目前,國內外對結腸小袋蟲的研究主要集中在流行病學的調查、臨床病例的診斷和治療等方面[3-5]。因此,有必要通過其體外培養體系的建立,進行該蟲的基因分型[6-7]、致病機制、免疫及藥物篩選等研究。目前用于該蟲體外培養的培養基有 RSS培養基、LE雙相培養基、TYSGM-9培養基存在配制繁瑣、穩定性較差、維持時間短等問題[8-9]。DMEM常用于細胞培養,而結腸小袋蟲也是一種單細胞的原蟲,我們利用DMEM為基礎培養基、輔以小牛血清和淀粉在體外成功地培養了這一原蟲,為了進一步研究最佳培養基組成和培養條件,本試驗利用正交設計法探討了淀粉量、小牛血清比例及培養液初始pH對蟲體最高種群密度的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 蟲種 采自洛陽市孟津縣某豬場自然感染的病豬糞便,直接鏡檢發現有大量滋養體,未見包囊。取糞便樣少許接種于改進型RSS培養基[9],在28℃條件下培養48 h,鏡檢發現大量活動滋養體后用于試驗研究。

1.1.2 試劑 DMEM培養基,10.0 g裝,Lot No.1342967,GIBCOTM;小牛血清,杭州四季青生物工程材料有限公司生產,生產批號為080424;碳酸氫鈉,西安化學試劑廠生產,批號為080623,分析純;可溶性淀粉,北京海淀區微生物培養基廠生產,批號080517,用前取適量裝入潔凈小瓶中高壓滅菌。

1.2 方法

1.2.1 DMEM培養液配制 用高壓滅菌雙蒸餾水溶解DMEM培養基,每1 000 mL加碳酸氫鈉3.7 g。培養基用G6濾器過濾除菌,4℃保存備用。使用前根據需要用鹽酸或氫氧化鈉溶液調整pH。

1.2.2 正交試驗設計 以結腸小袋蟲在培養基中所達到的最高種群密度為指標,以培養基中淀粉量/(mg/瓶)(A)、小牛血清比例/(mL?L-1)(B)和初始pH(C)3個因素為考察對象,每個因素選3個水平,利用L9(34)正交試驗設計進行試驗。具體因素水平見表1。

表1 因素水平Table 1 Factors and levels

1.2.3 蟲體接種及結果觀察 本試驗用安瓿進行培養,每個安瓿內液體總量為3 mL,按比例加入相應pH的DMEM培養液和小牛血清,并加入相應量的淀粉。一個試驗號設計兩個平行樣品,分別標記,進行有重復觀測值正交試驗[10]。培養基分裝完成后置于28℃平衡20 min,之后每個安瓿內加青霉素和鏈霉素各1萬單位/mL,并接種結腸小袋蟲滋養體懸液50 μ L/安瓿。檢查初始密度后,將安瓿加蓋放入28℃條件下培養,每12 h檢查1次,直至樣品種群密度連續兩次下降為止。檢查時,將每一個樣品混勻后取 40 μ L,滴于載玻片上,蓋上蓋玻片(18 mm×18 mm),100×鏡暗視野下檢查,計數30個視野下的蟲體數。同時,利用數碼顯微成像系統對培養的滋養體及分裂相拍照。

1.2.4 數據分析 以每一個樣品內蟲體最高種群密度為基本數據,利用有重復觀測值正交試驗方差分析法對結果進行分析,考查不同因素對獲得最高種群密度的影響,同時,利用多重比較確定某一因素3個水平中最佳水平,最終確定培養基最佳組成。

2 結果

2.1 DMEM培養后的結腸小袋蟲滋養體

結腸小袋蟲的滋養體在接種于DMEM并渡過適應期后,可迅速增殖,圖1A為接種培養96 h所獲取的照片。滋養體呈橢圓形或卵圓形,借助纖毛的擺動可快速旋轉前行,遇到障礙物時可迅速調頭,也可改變體形而通過一定寬度的縫隙。滋養體主要以橫二分裂法進行無性繁殖(圖1B),也見到出芽生殖的無性繁殖方法(圖1C)和接合生殖(圖1D)。

圖1 DMEM培養基中結腸小袋蟲滋養體及分裂相Fig.1 T rophozoites and fractionalism of Balantidium coli in DMEM medium

2.2 正交試驗結果

在初始接種量均為16個/30個視野的情況下,除3、5、7三個試驗號蟲體密度在接種培養后108 h達到最高值外,其余樣品均于96 h達到密度最高值。L9(34)正交試驗結果見表2。

表2 正交試驗結果Table 2 Results of orthogonal experiment design

(續表2)

2.3 方差分析

由表2極差可以看出,3個因素影響作用的主次順序為C＞A＞B。方差分析結果見表3。由于MSe1/MSe2＞1,MSe1與MSe2差異顯著,故以MSe2進行F檢驗和多重比較。F檢驗結果表明,淀粉量對獲得最高種群密度有顯著影響(P＜0.05),試驗范圍內不同血清比例對最高種群密度無顯著影響(P＞0.05),不同初始pH對獲得最高種群密度有極顯著影響(P＜0.01)。兩個組間差異不顯著(P＞0.05)。

2.4 多重比較

利用SSR法對不同淀粉量及不同初始pH下最高種群密度平均數進行了多重比較,結果見表4、表5。40 mg/安瓿(A3)條件下所獲得的最高種群密度極顯著高于30 mg/安瓿(A2),顯著高于20 mg/安瓿(A1),而后兩者差異不顯著。初始pH為7.0(C2)條件下所獲得了最高種群密度極顯著高于6.0(C1)及8.0(C3),后兩者差異也極顯著。

2.5 最佳培養基組成的確定

根據總體結果分析,A因素中A3最好,C因素中C2最好,B因素各水平之間差異不顯著,選實際觀測值最高的B1水平,因此最佳組合為A3B1C2,即淀粉量為40 mg/安瓿,血清量為150 mL/L(DMEM培養液2.55 mL+0.45 mL小牛血清),DMEM培養液初始pH為7.0。

表3 正交試驗結果方差分析Table 3 The variance analysis for data of orthogonal experiment design

表4 不同淀粉量下最高種群密度平均數的多重比較Table 4 M ultiple comparisons of the mean of maximum population density under different concentrations of starch(SSR method)

表5 不同初始pH條件下最高種群密度平均數的多重比較Table 5 M ultiple comparisons of the mean of maximum population density under different initial pH

3 討論

DMEM常用于細胞培養,但用其培養結腸小袋蟲國內外尚未見報道[8]。在初步試驗時,用此培養基加適量的小牛血清和淀粉可進行結腸小袋蟲培養。為了取得良好的培養基組成,本試驗利用正交設計法研究了培養效果,并進行了有重復觀測值的方差分析。在所研究的3個影響因素中,初始pH是最大的影響因素,在初始pH設定為7.0時所取得的最高種群密度極顯著高于6.0和8.0,這與利用RSS或改進型RSS培養基培養時的初始pH設定要求基本一致[9-11]。所不同的是,利用RSS或改進型RSS培養基培養時初始pH為6.5及8.0時,蟲體在初期少量增殖后密度迅速下降,表現明顯的不適應性,而本次試驗發現,在初始pH 為6.0和8.0條件下,蟲體仍然有一定繁殖能力,其原因須進一步研究[12]。

結腸小袋蟲通常以橫二分裂法及接合生殖法繁殖,但在本試驗觀察到蟲體還有出芽生殖方式,蟲體的末端先長出一個小的舌狀小突,之后舌狀小突逐漸長大并從母體脫落而成為一個新個體。

DMEM營養豐富,配制及使用方便,在適宜的初始pH條件下,可獲得比RSS或改進型RSS培養基更高的蟲體種群密度[9,11]。因此,在今后的研究中,可用DMEM培養基取代RSS或改進型RSS培養基進行結腸小袋蟲的體外培養。

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YAN Wen-chao1,WANG Tian-qi1,DING Ke1,ZHANG Ling1,HANG Li-fang1,WANG Xin-cai2

Orthogonal Experimental Design on Culture ofBalantidium coliin DMEM Medium

(1.Animal Science and Technology College,HenanUniversity of Science and Technology,Luoyang,Henan,471003,China;2.Medical College,Henan University of Science and Technology,Luoyang,Henan,471003,China)

The effects of three factors including concentrations of starch and serum proportion,the initial pH value of culture solution DMEM on the maximum population density ofBalantidium coliwere evaluated by L9(34)orthogonal design.The variance analysis of the experimental results showed that the initial pH was the primary factor,followed by concentrations of starch,and serum proportion had the weakest effect.The best medium for culture ofB.coli in vitrowas 40 mg/bottle of starch,serum proportion 150 mL/L in culture solution(2.55 mL culture solution DMEM +0.45 mL serum).The optimum initial pH of culture solution DMEM was 7.0.

Balantidium coli;orthogonal design;DMEM medium

S855.9

A

1007-5038(2010)08-0034-04

2010-04-12

河南省教育廳自然科學研究計劃項目(2009B23003)

閆文朝(1978-),男,河南淅川人,博士,主要從事原蟲分子遺傳學與免疫學研究。