微載體培養PK-15細胞試驗條件的優化

何錫忠,李春華,倪建平,蔣風英,鄒 勇*

(1.上海市農業科學院畜牧獸醫研究所,上海 201106;2.上海佳牧生物制品有限公司,上海 201106)

微載體培養PK-15細胞試驗條件的優化

何錫忠1,李春華1,倪建平2,蔣風英1,鄒 勇1*

(1.上海市農業科學院畜牧獸醫研究所,上海 201106;2.上海佳牧生物制品有限公司,上海 201106)

為了優化PK-15細胞在微載體上的生長條件,在微載體濃度5 mg/mL、低糖DMEM+100 mL/L NBS培養液條件下,觀察4.5×104cells/mL和8.7×104cells/mL的細胞接種密度對細胞生長的影響;在低糖DMEM+100 mL/L NBS培養液、接種密度5×104cells/mg條件下,觀察3、5、10 mg/mL微載體濃度對細胞生長的影響;在3 mg/mL微載體濃度條件下、接種密度25×104cells/mL,觀察MEM、高糖DMEM和低糖DMEM培養基對細胞生長的影響。結果表明,以微載體接種細胞密度4.5×104cells/mg、微載體濃度5 mg/mL在低糖DMEM培養基中培養方式效果最為理想。優化的培養工藝適用于PK-15細胞的生產。

微載體培養;PK-15細胞;培養條件

目前,我國病毒性疫苗的生產多采用扁瓶和滾瓶等靜置培養技術進行細胞培養和病毒復制,勞動強度高,占地面積大,而且生產不穩定,很難進行質量控制。Van Wezel A L[1]于1967年首先應用微載體系統培養貼壁依賴性細胞,此后這一技術得到了迅速發展。微載體系統由于具有高比表面積、細胞產量高、培養環境便于檢測和控制、生產規模易于放大等優點,已廣泛應用于狂犬病、脊髓灰質炎等疫苗的生產[2-3];對80種以上的貼壁細胞成功進行了大規模擴增,如293細胞、成肌細胞、CHO 細胞、Vero細胞[3-7]、Marc細胞[8]和ST細胞[9]等。由于細胞培養環境和微載體培養系統的操作條件影響不同細胞生長代謝和生理狀況,筆者通過研究細胞接種密度、微載體濃度和不同培養基種類與PK-15細胞生長的關系,考察培養過程中的限制性因素對PK-15細胞生長的影響,為獲得生長良好的高密度PK-15細胞培養提供試驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 PK-15細胞(無PCV-1污染)由上海市農業科學院畜牧獸醫研究所研發中心保存。

1.1.2 培養基 MEM、高糖 DMEM 和低糖DMEM為美國GIBCO-RBL公司產品;新生牛血清為Hyclone公司產品。

1.1.3 微載體(Cytodex TM 3) CT-3微載體購自Amersham pharmacia Biotch AB,使用前經無Ca2+、Mg2+的PBS緩沖液浸泡,1.055 kg/cm2高壓蒸汽滅菌30 min,再浸泡在含100 mL/L新生小牛血清的低糖DMEM 培養液中,置37℃、體積分數為5%CO2培養箱過夜,待用。

1.1.4 轉瓶 由華東理工大學生物反應器工程國家重點實驗室制備,總體積250 mL。

1.1.5 CelliGen生物反應器 由New Brunswick Scientific Co.LTD USA 生產,工作體積1.2 L,溶解氧(DO)和 pH 由壓縮 Air、N2、O2和CO24種氣體控制,籠式攪拌槳由磁力驅動器驅動。

1.2 方法

1.2.1 靜置培養 PK-15細胞生長至3 d～4 d后,細胞基本鋪滿方瓶時,先用含0.2 g/L EDTA的PBS清洗 2次,再加入2.5 g/L胰酶溶液消化,傾去胰酶,加低糖DMEM培養基,吹打,T-50方瓶以1∶3～1∶4的比率傳代。

1.2.2 微載體系統培養 CT-3微載體,經無Ca2+、Mg2+的PBS緩沖液浸泡,1.055 kg/cm2高壓蒸汽滅菌30 min,再浸泡在含100 mL/L新生小牛血清的低糖DMEM 培養基中,置37℃、體積分數為5%CO2培養箱過夜,待用。加入適量微載體和細胞于250 mL轉瓶中,工作體積100 mL,采用間隙換液的培養方式,于37℃、體積分數為5%CO2培養箱中培養,轉速度第1天為30 r/min,此后均為40 r/min～45 r/min。對影響PK-15細胞在微載體快速均勻貼壁的培養基、接種細胞接種密度、微載體濃度等條件進行優化比較。

1.2.2.1 培養基對細胞生長的影響 在3 mg/mL微載體濃度條件下、接種密度25×104cells/mL,觀察含 100 mL/L NBS的 MEM、高糖 DMEM(DMEM-HG)100 mL/L NBS和低糖 DMEM(DMEM-LG)100 mL/L NBS培養基對細胞生長的影響。

1.2.2.2 細胞接種密度對細胞生長的影響 在微載體濃度 5 mg/mL、培養液低糖 DMEM+100 mL/L NBS條件下,從48 h開始,每12 h換液50%,觀察4.5×104cells/mL和8.7×104cells/mL的細胞接種密度對細胞生長的影響。

1.2.2.3 微載體濃度對細胞生長的影響 在優化細胞接種密度的基礎上,在培養液低糖DMEM+100 mL/L NBS、接種密度5×104cells/mg條件下,自48 h開始,每 12 h換液 50%,觀察 3、5、10 mg/mL微載體濃度對細胞生長的影響。

1.2.3 生物反應器培養PK-15細胞 安裝好反應器和管路后,分別用pH為4.00和6.86的標準pH溶液在25℃下標定pH電極。在罐體內加入PBS液,1.055 kg/cm2高壓蒸汽滅菌45 min。冷卻后安裝到反應器控制系統上,連接好壓縮Air、N2、O2和CO24種氣體的氣路管線,校正DO電極后,將罐內PBS壓出,工作體積1.2 L,加入適量微載體和種子細胞,控制溶氧(DO)為40%空氣飽和度,攪拌速度為40 r/min～55 r/min,溫度為37℃,pH 7.0。籠式攪拌槳由磁力驅動器驅動。

1.2.4 活細胞計數 方瓶中的單層細胞經胰酶消化、重懸后,直接用血細胞計數板計數;微載體上的細胞先用PBS漂洗2次,用含10 g/L結晶紫的檸檬酸溶液染色,用血細胞計數板計數細胞核。

2 結果

2.1 靜置法培養PK-15細胞的生長

在方瓶中PK-15細胞的最高密度達到1.78×106cells/mL,細胞擴增了3.6倍。對數生長期的平均細胞比生長速率約為每天0.59,最高比生長速率為每天0.74。

2.2 不同培養基對PK-15細胞生長的影響

由表1可知,在3 mg/mL微載體濃度條件下、接種密度25×104cells/mL,采用低糖DMEM 培養基培養PK-15細胞所能達到最終細胞密度為1.8×106cells/mL,比 MEM 高30%,比高 糖DMEM 高22%。

表1 不同培養基對PK-15細胞生長的影響Table 1 Effect of different media on g rowth of on PK-15 cells

2.3 不同細胞接種密度對PK-15細胞生長的影響

由表2可知,在培養液低糖DMEM+100 mL/L NBS、5 mg/mL的相同微載體濃度下,PK-15細胞接種密度為4.5×104cells/mg MC和8.7×104cells/mg MC時,所能達到的最高細胞密度分別為2.90×106cells/mL和3.74×106cells/mL,擴增倍數分別為12.1和 8.6倍。

表2 不同細胞接種密度對PK-15細胞生長的影響Table 2 Effect of densities of cells inoculated on growth of PK-15 cells

2.4 不同微載體濃度對PK-15細胞生長的影響

由表 3可知,在培養液低糖 DMEM+100 mL/L NBS、接種密度5×104cells/mg條件下,隨著微載體濃度提高,細胞密度也相應提高。用相同的表面積細胞密度接種,3、5、10 mg/mL微載體濃度所能達到的最高細胞密度分別為1.67×106、3.14×106、5.91×106cells/mL。

表3 不同微載體濃度對PK-15細胞生長的影響Table 3 Effect of microcarrier concentrations on growth of PK-15 cells

2.5 不同規格生物反應器培養PK-15細胞的生長

由表4可知,在低糖-DMEM、5 g/L微載體濃度和5×104cells/mg MC細胞接種密度條件下進行1 L和5 L生物反應器中PK-15細胞培養,在接種后第5天達到最高細胞密度分別為3.25×106cells/mL和3.36×106cells/mL,細胞擴增了13倍,差異不顯著。

表4 不同規格生物反應器培養PK-15細胞的生長情況Table 4 Grow th of PK-15 cells in different bioreacto r

3 討論

本試驗比較了 MEM、高糖 DMEM和低糖DMEM 培養基對細胞生長的影響,結果發現,采用低糖DMEM培養基培養PK-15細胞所能達到最終細胞密度為1.8×106/mL,比MEM 高30%,比高糖DMEM高22%。代謝分析表明,低糖DMEM中葡萄糖利用率明顯比高糖DMEM高,這是因為更多的葡萄糖轉化為細胞生長提供能量和物質來源[10],而在高糖培養環境中,代謝過程中所多余的葡萄糖生成乳酸是其他培養液的 5倍[11],氨離子濃度最低,因此在長時間(36 h以上)培養時,應采用間歇換液的方式,以消除代謝產物給細胞生長帶來的不利影響[12-13]。這正是低糖DMEM和高糖DMEM培養基引起細胞生長和最高細胞密度出現差異的根本原因。

研究表明,PK-15細胞生長與細胞表面積接種無相關性。當接種密度為為4.5×104cells/mg MC和8.7×104cells/mg MC時,最高細胞密度并沒有因細胞接種密度的翻倍而成倍的增加,僅增加了28%。高密度接種時,細胞更容易進入對數生長期,但高密度接種的細胞受到的接觸抑制作用程度比低密度接種的更強,使得細胞比生長速率較快下降。因此,PK-15細胞培養過程中為使培養過程能保持較高的細胞比生長速率,并獲得更高的細胞擴增倍數,提高培養過程的效率,同時可以減少種子細胞的制備量。以4.5×104cells/mg MC左右為宜。

隨著微載體濃度增加,最高細胞密度也相應增加,3、5、10 mg/mL 的載體,其面積比為1∶1.7∶3.3,但相應的細胞密度比卻為1∶1.8∶3.6,說明微載體濃度與 PK-15細胞密度僅有一定程度的相關性。微載體濃度越高,細胞生長期越長,采用10 mg/mL微載體培養至第6天才達到最高細胞密度,高濃度微載體的表面積未能充分被利用。為了更快更經濟地獲得較高密度的健康細胞,在大規模培養 PK-15細胞時,應選擇5 mg/mL的微載體濃度。

應用生物反應器系統和微載體技術培養PK-15細胞,在細胞密度、擴增倍數、比生長速率等方面均優于靜置和轉瓶培養。

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Optimization of Condition for Culture of PK-15 Cell by Microcarrier

HE Xi-zhong1,LI Chun-hua1,NI Jian-ping2,JIAG Feng-ying1,ZOU Yong1

(1.Animal Husbandry and Veterinary Research Institute,Shanghai Academy of Agricultural Sciences,Shanghai,201106,China;2.Shanghai J iamu Biological Production Co.,L TD,Shanghai,201106,China)

The aim of this study is to optimize the cultural condition of PK-15 cell by microcarrier system.On the condition of 5 mg/mL microcarrier concentration and low sugar DMEM containing 100 mL/L NBS as culture fluid,the effects on PK-15 cell growth at 4.5×104cells/mL and 8.7×104cells/mL inoculation density were observed.On the condition of low sugar DMEM containing 100 mL/L NBS as culture fluid and the 5×104cells/mg inoculation density,the effects on PK-15 cell growth at 3,5,10 mg/mL microcarrier concentration were observed.On the condition of 3mg/mL microcarrier concentration and the 25×104cells/mL inoculations density,the effects on PK-15 cell grow th by using MEM,high sugar DMEM or low sugar DMEM as culture fluid were observed.The results showed that the optimal culture conditions were 4.5×104cells/mg inoculation density,5 mg/mL microcarrier concentration,and low sugar DMEM as culture fluid.Optimal cultural technology could apply for the production of PK-15 cell.

microcarrier culture(MC);PK-15 cell;culture condition

Q813.11

A

1007-5038(2010)08-0020-04

2009-12-31

資金項目:上海市科委科技發展基金項目(04391930)

何錫忠(1966-),男,上海人,獸醫師,碩士,主要從事獸用疫苗研究。*通訊作者