高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒ORF3基因的原核表達*

徐明明,劉永剛,王淑杰,武嘉男,石文達,李麗琴,榮福龍,蔡雪輝*

(1.東北農業大學,黑龍江哈爾濱 150001;2.中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所獸醫生物技術國家重點實驗室/豬傳染病研究室,黑龍江哈爾濱 150001)

高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒ORF3基因的原核表達*

徐明明1,2,劉永剛2,王淑杰2,武嘉男2,石文達2,李麗琴2,榮福龍1,2,蔡雪輝2*

(1.東北農業大學,黑龍江哈爾濱 150001;2.中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所獸醫生物技術國家重點實驗室/豬傳染病研究室,黑龍江哈爾濱 150001)

為進一步研究豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)GP3蛋白的結構、功能及免疫學特性,根據GenBank中已發表的高致病性PRRSV HuN4株ORF3基因序列,設計合成擴增PRRSV ORF3基因的引物。將擴增的基因克隆到表達載體pProEx H Tb中,轉化到大腸埃希菌BL21進行表達。Western blot分析表明,GP3蛋白在大腸埃希菌中獲得正確表達,且具有良好的反應活性。將純化的GP3蛋白免疫小鼠制備抗GP3多克隆血清,酶聯免疫吸附試驗(ELISA)測定其效價,結果在小鼠體內產生較高滴度的特異性抗體,證明PRRSV GP3蛋白具有良好的抗原性。

高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒;ORF3蛋白;原核表達;抗原性

豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)屬于尼多病毒目(Nidovirales)、動脈炎病毒科(Arteriviridae)、動脈炎病毒屬(Arterivirus),能引起豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS),俗稱“豬藍耳病”。臨床表現為母豬晚期流產、早產、死胎、木乃伊胎等繁殖障礙和各年齡豬群的呼吸道癥狀。該病于1996年在我國有發生的報道[1],因為沒有有效的防控手段,成為養豬業難以解決的問題。尤其是2006年高致病性豬藍耳病的暴發,流行范圍廣,傳播速度快,持續時間長,病死數量多,給我國的養豬業帶來了巨大的經濟損失,經研究證實高致病性PRRSV(HP-PRRSV)變異株是引起該病的主要病原之一[2]。PRRSV基因組為不分節段的單股正鏈RNA,全長約15 kb,包括9個開放閱讀框。根據血清型和遺傳特性的差異,可將PRRSV劃分為兩個基因型即歐洲型和美洲型。

PRRSV GP3是蛋白由ORF3基因編碼的一種高度糖基化蛋白,在病毒的致病性、復制、裝配、變異和保護性反應等方面可能具有重要意義。GP3在病毒粒子中含量較少,研究的也不是很透徹,對于GP3是否為結構蛋白尚存在爭議[3]。應用單克隆抗體技術發現GP3中包含中和表位,可以誘導機體產生中和抗體[4]。GP3是PRRSV各毒株之間保守性最差的蛋白之一,將HP-PRRSV與經典株進行氨基酸序列比對,發現GP3的氨基酸突變位點數量最多。本研究利用大腸埃希菌表達HP-PRRSV HuN4株GP3,為進一步研究GP3的結構、功能及免疫學特性奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒、菌株、質粒和血清 PRRSV HuN4株、感受態細胞JM109、感受態細胞BL21、載體質粒pProEx HTb,均由豬病綜合防治組保存;PRRSV HuN4株豬陽性血清由哈爾濱獸醫研究所豬病綜合防治組制備并保存。

1.1.2 主要試劑 限制性核酸內切酶(BamHⅠ和EcoRⅠ)、T4 DNA 連接酶、Vector-pMD18T 試劑盒、DNA Marker和蛋白質Marker和膠回收試劑盒,均購自寶生物工程(大連)有限公司;HRP標記的兔抗豬IgG,購自Sigma-Aldrich公司。

1.2 方法

1.2.1 目的基因的擴增與克隆 用生物學軟件對PRRSV HuN4株(登錄號EF635006.1)ORF3基因的氨基酸序列進行抗原性、親水性、疏水性等分析,去除位于ORF3基因N端的(1 aa～49 aa)一部分疏水性區域,設計并合成一對用于擴增ORF3基因的引物,上下游引物兩端分別加入BamHⅠ和EcoRⅠ位 點,序 列 為: 上 游 引 物 5′GCTGGATCCAGGGGCAATTTTTCTT -TT 3′;下游引物 5′-ATAC GAATTCCTATTTTGCGAATCGTCGGA-3′,引物的合成由北京百泰克公司完成。以PRRSV HuN4株總RNA反轉錄合成的cDNA為模板,PCR反應程序為:95℃5 min,94℃1 min;50℃45 s,72℃45 s,35個循環;72℃10 min。PCR產物經膠回收試劑盒回收純化后連接于pMD18-T載體上,轉化至感受態細胞JM109中,提取質粒,經PCR和酶切鑒定的陽性重組質粒命名為pMD18-ORF3。

1.2.2 表達載體的構建 將pMD18-ORF3與pProEx HT b同時經BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切后,用T4 DNA連接酶22℃連接2 h,連接產物轉化至感受態細胞JM109中,提取質粒,將經酶切鑒定的陽性重組質粒命名為pH-ORF3。

1.2.3 重組蛋白的表達 將重組質粒pH-ORF3轉化大腸埃希菌BL21感受態細胞,在轉化的平皿中挑取單菌落,37℃振蕩培養過夜,同時轉化載體作為對照。將培養物以1∶100的比例接種于 LB液體培養基中,于37℃振蕩培養至OD600nm達到0.6～0.8時,加入終濃度為1.0 mmol/L的IPTG,分別于誘導前和誘導后 3、4、5、6 h收集菌液,聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測。

1.2.4 重組蛋白的純化 大量表達后收集細菌,分別用 2、4、6 mol/L尿素超聲洗滌包涵體,再用8 mol/L尿素將包涵體溶解。再向其加入2×SDS上樣buffer水煮 5 min后進行SDS-PAGE。SDSPAGE結束后用0.25 mol/L～0.3 mol/L KCl染色凝膠30 s～60 s,對光將目的蛋白切下,然后用電洗脫儀洗脫5 h,收集蛋白并測定濃度。

1.2.5 Western blot鑒定 將純化的蛋白進行SDS-PAGE后,電轉印到硝酸纖維素膜上,50 g/L脫脂乳4℃封閉過夜,加入1∶50倍稀釋的PRRSV豬陽性血清,37℃孵育1 h,加1∶20 000倍稀釋的HRP標記的兔抗豬IgG,37℃孵育1 h,DAB顯色5 min,去離子水終止。

1.2.6 小鼠GP3抗血清的制備及測定 將30 μ g純化的GP3抗原加入等體積的福氏完全佐劑,乳化后采用皮下多點注射免疫6周齡的Balb/c雌性小鼠5只。初次免疫后第14天用同樣抗原加等體積弗氏不完全佐劑進行第2次加強免疫,第2次免疫后7 d和28 d分別斷尾采血。以本室制備的昆蟲細胞表達并純化的GP3作為包被抗原,采用間接ELISA方法,測定OD450nm值,檢測小鼠血清中抗體效價。

2 結果

2.1 PCR擴增及酶切鑒定結果

提取HP-PRRSV HuN4株總RNA,反轉錄合成cDNA,通過特異性引物PCR擴增出ORF3基因,擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳可見大約為620 bp的特異性擴增片段,與預期大小相符。陽性質粒經BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切后,分別切出與目的片段大小一致的片段(圖1),序列測定結果表明ORF3基因正確地插入到pProEx HTb載體。

圖1 重組pH-ORF3的酶切鑒定Fig.1 Identification of pH-ORF3 by restriction enzyme digestion

2.2 重組蛋白的表達及純化結果

對誘導前和誘導后3、4、5、6 h的樣品進行SDSPAGE分析,同時設立空載體誘導4 h為對照。結果表明,重組菌在誘導后分別出現大小約為25 ku的蛋白條帶,大小與預期的蛋白分子質量基本一致。重組蛋白的表達量隨誘導時間的延長而增加,目的蛋白在誘導后4 h表達量最高,隨后表達量降低。將重組菌超聲破碎后進行SDS-PAGE分析,發現重組蛋白主要以包涵體形式表達。用不同濃度的尿素洗滌、溶解包涵體,SDS-PAGE分析重組蛋白雜蛋白很少,進一步切膠純化,得到純度較高的目的蛋白(圖2)。

圖2 重組GP3的表達與純化的SDS-PAGE鑒定Fig.2 SDS-PAGE analysis of expressed and purified GP3

2.3 Western blot鑒定結果

用PRRSV陽性血清與純化的表達產物進行Western blot分析。結果顯示GP3在大小約25 ku處出現特異性反應條帶,空載體對照未出現條帶(圖3)。表明重組蛋白在大腸埃希菌中得到了正確表達,且表達的蛋白具有良好的反應原性。

圖3 重組GP3的Western blot鑒定Fig.3 Western blot analy sis of recombinant GP3

2.4 小鼠血清抗體檢測結果

以免疫前的小鼠血清及用PBS免疫的小鼠血清作為陰性對照,以P/N≥2.1的血清最高稀釋度為抗體效價。結果顯示,第2次免疫后7 d采血檢測GP3的抗體效價為1∶12 800以上,并可持續到第2次免疫后的第28天。說明表達的HP-PRRSV HuN4株GP3具有較好的免疫原性,可以誘導小鼠產生較高水平的免疫應答反應。

3 討論

目前,對 PRRSV的主要結構蛋白GP5、M、N研究的比較清楚,對次要結構蛋白GP3的結構和功能等方面研究的較少。在對歐洲株LV株的研究中已經證明GP3參與病毒粒子囊膜的組裝,是病毒的結構蛋白[5],而對于加拿大Quebec IAF-Klop株研究表明GP3不是病毒粒子的組成成分,而是弱的膜相關蛋白[6-7]。最新研究表明,美洲株 FL12株的GP3同歐洲株的一樣,都是病毒的結構蛋白[8]。因為對GP3的結構與功能研究不是很透徹,所得到的結論也常有互相抵觸的現象,因此有必要對該蛋白進行深入研究。GP3是PRRSV各毒株之間保守性最差的蛋白之一,將HP-PRRSV與經典株進行氨基酸序列比對,發現GP3的氨基酸突變位點數量最多,共有8個位點突變,其中有4個屬于非保守性突變,3個位于預測的抗原表位,1個位于C末端,第83位保守性突變可能與PRRSV毒力相關[9]。

在本研究中根據對HP-PRRSV HuN4株GP3的氨基酸序列進行抗原性、親水性、疏水性等分析,去除了其位于N端的(1 aa～49 aa)一部分疏水性區域,然后對其進行了融合表達。從表達產物的Western blot反應結果來看,去除其疏水性區域對該蛋白的反應活性沒有造成影響,這與蔣文明等[10]、劉金霞等[11]的研究結果一致。

因為HP-PRRSV變異株與經典株在進化樹中位于不同的分支中[12],所以現地使用的來自于經典毒株的疫苗對于高致病性PRRSV可能起不到理想的免疫保護效果,因此需要利用HP-PRRSV來開發新型疫苗。有研究發現GP3可以誘導機體產生中和抗體并能中和病毒,而且針對GP3的抗體無抗體依賴性增強作用[4]。Plana D J等[13]用桿狀病毒系統表達GP3,該蛋白免疫接種后能夠保護豬不受PRRSV感染,保護率達到68.4%。因此,GP3可作為開發基因工程疫苗的候選抗原,深入研究GP3的免疫特性及其相應功能具有一定的理論意義和實踐意義。總之,本研究利用大腸埃希菌成功表達HPPRRSV HuN4株GP3,并證明該蛋白具有良好的免疫原性,為進一步研究GP3的結構、功能以及研制新型PRRSV診斷試劑和基因工程疫苗奠定基礎。

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Prokaryotic Expression of Highly Pathogenic PRRSV ORF3 Gene

XU Ming-ming1,2,LIU Yong-gang2,WANG Shu-jie2,WU Jia-nan2,SHI Wen-da2,LI Li-qin2,RONG Fu-long1,2,CAI Xue-hui2

(1.Northeast Agricultural University,Harbin,Heilongjiang,150001,China;2.Division of Swine Inf ectious Diseases,State Key Laboratory of Veterinary Biotechnology,Harbin Veterinary Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences,Harbin,Heilongjiang,150001,China)

To further study the structure,function and immunogenicity of highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus(PRRSV)GP3.A pair of primers for ORF3 gene of PRRSV were designed according to the PRRSV(HuN4 strain)sequence available in GenBank.The ORF3 gene of PRRSV was cloned into the expression vector pProEx H Tb and the recombinant plasmid was transformed intoE.colicompetent cells BL21.Expression of fusion protein inE.coliwas observed by Western blot.The purified GP3 was inoculated into Balb/c mice to prepare anti-GP3 serum,the specificity and titer of the antiserum were evaluated by ELISA.Specific high titer antibodies were detected in the vaccinated mice.The results showed that the GP3 expressed inE.colicould induce high antibody titer against GP3,and had strong antigenicity.

Porcine reproductive and respiratory syndrome virus;ORF3 gene;prokaryotic expression;antigenicity

S852.659.6;S858.28

A

1007-5038(2010)08-0008-04

2010-01-15

資金項目:十一五國家支撐計劃項目(2006BAD06A07)

徐明明(1984-),女,黑龍江安達人,碩士研究生,主要從事動物病毒分子免疫學研究。*通訊作者