奶山羊胎兒成纖維細胞的分離培養及SRY基因性別鑒定*

陳華濤,胡林勇,楊 艷,李 倩,靳亞平

(西北農林科技大學動物醫學院,農業部動物生殖生理和胚胎工程重點開放實驗室,陜西楊陵 712100)

奶山羊胎兒成纖維細胞的分離培養及SRY基因性別鑒定*

陳華濤,胡林勇,楊 艷,李 倩,靳亞平*

(西北農林科技大學動物醫學院,農業部動物生殖生理和胚胎工程重點開放實驗室,陜西楊陵 712100)

為了探索和建立奶山羊胎兒成纖維細胞體外分離培養及性別鑒定的技術方法,獲得轉基因克隆羊的供體細胞,本試驗用組織塊培養法分離純化得到兩株奶山羊胎兒成纖維細胞系,進行細胞形態觀察、生長曲線及細胞周期和倍性分析。同時根據GenBank上發布的山羊SRY基因設計合成一對PCR引物作為性別鑒定引物,另外根據山羊BLG基因序列設計一對引物作為內參引物,建立PCR反應體系對兩株胎兒成纖維細胞系進行性別鑒定。結果表明,分離的胎兒成纖維細胞活力良好,可在體外快速生長、增殖、穩定培養;陽性對照和山羊胎兒成纖維細胞系2經PCR擴增得到337 bp片段和498 bp的BLG基因片段,而陰性對照和山羊胎兒成纖維細胞系1經PCR擴增得到498 bp的β-乳球蛋白基因片段。將337 bp片段和pMD19-T載體連接,構建重組載體pSRY,通過測序證明337 bp片段為SRY基因片段。這說明有337 bp擴增帶的細胞系為雄性,無337 bp擴增帶的細胞系為雌性。本試驗為轉基因奶山羊新品種的培育奠定了基礎。

奶山羊;成纖維細胞;SRY基因;性別鑒定

*通訊作者

近年來,基于細胞核移植技術及細胞介導的轉基因技術的發展,為精確改造家畜的基因型提供了比傳統的育種篩選方案更為直接快速的方法。通過體細胞核移植技術已經成功的獲得了轉基因牛[1-3]、綿羊[4]、豬[5]、山羊[6-7]等動物。胎兒成纖維細胞容易分離,培養和轉染,適合作為供體細胞通過體細胞核移植技術來生產轉基因動物,其已經成為生產轉基因克隆動物所普遍應用的體細胞系。然而,體細胞系有一個主要的缺點,細胞的壽命是有限的。它們的增殖能力取決于動物種類,山羊和綿羊成纖維細胞增殖次數在40～120之間,牛和豬成纖維細胞增殖次數在30～50之間[8-10]。不同個體分離的胎兒成纖維細胞系,其活力也存在差別。

奶山羊具有妊娠周期短、產奶量較綿羊高、抗病力強及飼養成本低的優點,使其成為了理想的轉基因宿主動物。為了獲得具有體外傳代次數多,基因組穩定,活力強的奶山羊胎兒成纖維細胞系,本研究在前人研究的基礎上,從配種后30 d奶山羊胎兒中分離培養胎兒成纖維細胞,并用組織塊貼壁培養法進行原代培養,在傳代過程中觀察總結了體外培養成纖維細胞的生長特征,用PCR法鑒定了胎兒性別,為后續山羊體細胞克隆與胚胎移植及高產優質奶山羊新品種的培育奠定前期基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗用材料 配種后30 d的奶山羊胎兒、陽性對照和陰性對照羊血液,取自西北農林科技大學克隆羊基地。

1.1.2 主要試劑 DMEM/F12,Gibco產品;胰蛋白酶,二甲基亞砜(DMSO)以及其他無機鹽為Sigma公司產品;胎牛血清(FBS),Hyclone公司產品;蛋白酶K、基因組提取試劑盒、膠回收試劑盒,天根公司產品;pMD19T載體、Taq酶,Takara公司產品;二甲基噻唑二苯基四唑溴鹽(MTT);青霉素和鏈霉素,哈藥集團制藥總廠產品。

1.1.3 主要儀器設備 SW-CJ-1F超凈工作臺(蘇凈集團安泰公司);Conic,XDS-1B(組織培養倒置顯微鏡);BB5060UV CO2恒溫培養箱(Heraeus公司);U410-86超低溫冰箱(NBS公司);5430R高速離心機(Eppendorf公司);ZHWY-100B恒溫振蕩器(上海智城分析儀器制造有限公司),TC-96/G/H梯度PCR儀(杭州博日科技有限公司);細胞培養板和培養瓶(Costar公司)。

1.2 方法

1.2.1 奶山羊胎兒成纖維細胞的分離培養 通過外科手術法,無菌操作取出2只配種后30 d的胎兒,迅速將其放入盛有PBS溶液的保溫杯內,溶液內含有雙抗。1 h內送至實驗室,并迅速轉移至超凈臺內,于培養皿內加750 mL/L的乙醇浸泡1 min,然后用PBS沖洗胎兒3次。將胎兒轉入另一加入PBS的培養皿中,去除四肢、頭部和內臟。余下的組織在無菌PBS液中洗滌2次～3次后轉移至青霉素小瓶內,用眼科剪刀,將剪碎的組織塊轉移到60 mm培養皿中,并借助彎頭吸管使組織塊均勻分布于生長面。將培養皿倒置與37℃、體積分數為5%的CO2、飽和濕度的培養箱中,培養 5 h～6 h后,待組織塊周圍開始變干前加入4 mL含100 mL/L胎牛血清和200單位/mL雙抗的DMEM/F12培養液。培養2 d～3 d時,成纖維細胞從組織塊周圍蔓延生長出來,將原來的培養液換為等量的新培養液,繼續培養,此后每隔 3 d觀察換液。待細胞長至80%～90%匯合時,將一部分細胞凍存起來,一部分按1∶5的比例傳代培養。

1.2.2 奶山羊胎兒成纖維細胞系的性別鑒定

1.2.2.1 引物設計 根據NCBI中檢索得到山羊SRY基因全序列,運用Primer Primenr5引物設計軟件設計引物:SRYU 5′-GAACGAAGACGAAAGGTGGC-3′,SRYD 5′-GGGACTGTGAGCGGCATAAT-3′,預期產物為337 bp。根據β-乳球蛋白基因序列設計設計合成1對內標引物:BLGU 5′-CACTTGTTCGCCTAAATCCG-3′,BLGD 5′-AGCCTCACTGTCAACTCTGC-3′,預期產物為498 bp。引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.2.2.2 基因組DNA的提取 用天根血液、細胞、基因組提取試劑盒提取奶山羊胎兒成纖維細胞基因組DNA,陰性、陽性對照羊血液基因組DNA,作為PCR反應的模板。

1.2.2.3 PCR反應體系及反應條件 采用50 μ L反應體系,以山羊基因組DNA為模板,其中基因組模 板 為 2 μ L,10 × PCR buffer(Mg2+)5 μ L,10 mmol/L dNTP Mixture 4 μ L,引 物 各 1 μ L(20 μ mol/L),TaqPolymerse 0.5 μ L,ddH2O 34.5 μ L;PCR擴增條件為:94℃3 min;94℃30 s,59℃30 s,72℃20 s,30個循環;72℃8 min。PCR產物用20 g/L瓊脂糖凝膠進行電泳分析。

1.2.2.4 pSRY重組質粒的構建、測序及同源性分析 SRY基因PCR產物用天根膠回收試劑盒回收,膠回收產物與pMD19-T載體按5∶1摩爾數的比例混合,10 μ L連接反應體積中含 SolutionⅠ5 μ L,16 ℃連接 3 h,轉化 200 μ L 感受態 DH5α后,涂布于含60 μ g/mL氨芐青霉素的SOB固體培養板上(含X-gal/IPTG),37℃培養過夜,挑取白色菌落,提取重組質粒,進行酶切鑒定,目標重組質粒命名為pSRY。將pSRY重組質粒用M13通用引物測序,測序結果與GenBank上的SRY基因序列進行同源性分析。

1.2.3 MT T法生長曲線的測定 取第4代處于對數生長期的細胞,常規消化進行細胞計數,按2×104/mL的密度接種于 96孔培養板,每孔接種150 μ L。從接種時間算起,每隔 24 h選取 3孔吸棄50 μ L培養液后加入20 μ L MTT 溶液(5 mg/mL),37℃繼續孵育4 h,4 h后將各孔中的每一孔吸棄100 μ L液體,盡量避免將針狀結晶棄掉,各孔加入150 μ L DMSO溶解緩沖液,37℃過夜。于次日將處理好的3孔液體轉入另一96孔板,在酶聯免疫檢測儀上,于492 nm處以加入MT T溶液和DMSO溶解緩沖液的培養液調“0”,測定各孔光吸收值,記錄結果。以培養時間(d)為橫坐標,平均OD值為縱坐標作生長曲線。

1.2.4 細胞增殖周期測定及細胞倍性分析 消化對數生長期的第4代和第15代的奶山羊胎兒成纖維細胞,將消化下來的細胞分別用2.5 mL的PBS洗滌2次(800 r/min～1 000 r/min離心5 min),棄上清,然后加入1 mL的PBS將細胞混勻,再加入2 mL無水乙醇立即震蕩混勻,封口膜封口,置于冰盒送檢,用流式細胞儀檢測細胞周期和DNA倍體。

2 結果

2.1 奶山羊胎兒成纖維細胞系的分離培養

通過外科手術法,獲得了2只30 d的奶山羊胎兒(圖1)。按照細胞原代培養的組織塊培養法得到了胎兒的原代成纖維細胞,并通過細胞傳代分別獲得了GFF1、GFF2兩株胎兒成纖維細胞系,分別來自這2只胎兒。組織塊培養第3天,細胞從組織塊游離出,此時的細胞混有一部分上皮樣細胞(圖2)。培養7 d時,細胞生長良好,活力旺盛,鋪滿皿底(圖3)。

圖1 30 d胎兒Fig.1 Goat fetus of 30 day s

圖2 培養3 d時成纖維細胞遷移生長出組織塊(40×) Fig.2 T he growth and emigration of fetal fibroblasts in vitro at 3 days(40×)

2.2 胎兒成纖維細胞系的性別鑒定

圖3 培養7 d時長至成纖維細胞匯合(40×)Fig.3 The confluence of fetal fibroblasts in vitro at 7 days(40×)

分別以公山羊、母山羊血液基因組為陽性、陰性對照,檢測了GFF1、GFF2兩株細胞系。結果顯示,陽性對照組及GFF2擴增出337 bp(SRY基因)和498 bp(BLG內參)大小的兩個條帶,而陰性對照及GFF1只擴增出498 bp的一個條帶,這表明GFF1為雌性細胞系,GFF2為雄性細胞系(圖4)。

圖4 山羊胎兒成纖維細胞系SRY-PCR擴增結果 Fig.4 Amplified results of goat fetal fibroblasts by SRY-PCR

2.3 奶山羊SRY基因序列測序與同源性分析結果

將PCR產物回收后與pMD19-T載體連接、轉化、篩選,成功構建pSRY載體,挑選陽性克隆由南京金斯瑞生物科技有限公司進行測序,測序結果如圖5所示。測序結果與NCBI上發表的SRY基因序列99%同源,更進一步說明了性別鑒定結果的正確性。

圖5 PCR產物測序結果Fig.5 The sequencing results of PCR products

2.4 奶山羊胎兒成纖維細胞的生長曲線

從生長曲線可見,奶山羊胎兒成纖維細胞接種后第1～2天生長較慢,第3天開始快速生長,進入對數生長期,第5天到達高峰期,隨后進入平臺期,第7天細胞生長減慢,細胞開始死亡(圖6)。

2.5 細胞周期測定及細胞倍性分析結果

奶山羊胎兒成纖維細胞第4代(T0)和第15代(T15)的細胞生長周期流式細胞儀檢測結果如圖7、圖8所示,數據分析見表1。

(1)計算不同代次細胞的DNA指數(DI):第4代細胞為正常二倍體對照細胞,DI=70.88(T15)/69.23(T0)=1.02≈1.0,根據判定標準,DI=1.00±0.1為二倍體,說明第15代胎兒成纖維細胞細胞仍為正常的二倍體細胞。此細胞經長時間的體外培養傳代后,染色體倍體仍正常。此胎兒成纖維細胞系可用于后續的核移植和細胞篩選試驗。

(2)計算不同代次細胞的增殖指數(PI):PI(T0)=%(G2+S)=90.33%,PI(T15)=%(G2+S)=91.69%,這兩個代次細胞增殖指數讀很高,且相差不大,說明奶山羊胎兒成纖維細胞活力很強,經歷長時間的傳代后,其增殖能力基本沒有變化。為以后細胞經受長時間的藥物篩選提供前提條件。

圖6 奶山羊胎兒成纖維細胞的生長曲線Fig.6 T he growth curve of fetal fibroblasts of dairy goat

表1 奶山羊胎兒成纖維細胞第4代和第15代細胞生長周期比較Table 1 The comparison of cell growth cycle between passage 4 cells and passsage 15 cells

圖7 第4代胎兒成纖維細胞生長周期Fig.7 The cell growth cycle of passage 4 cells

圖8 第15代胎兒成纖維細胞生長周期Fig.8 The cell growth cycle of passage 15 cells

3 討論

3.1 山羊胎兒成纖維細胞培養

當前對胎兒成纖維細胞培養比較常用的方法主要有兩種,即組織塊貼壁培養法和分離單細胞接種培養法。組織塊貼附法具有簡單方便,細胞均質性好,易于操作,避免對細胞造成傷害,節約費用和成功率高等優點,培養動物成纖維細胞多采用此法[11-12]。分離單細胞接種培養法雖然也可以較好的培養細胞,但消化酶對細胞的傷害較大,會影響原代細胞的存活率和貼壁率。因此,本試驗選用組織塊貼壁培養法培養細胞。屠迪等[13]研究表明,組織塊培養法培養的牦牛原代胎兒成纖維細胞和早期傳代細胞中,會混有較多的上皮樣細胞,需要多次傳代才能得到高純度的細胞。成纖維細胞和上皮細胞相比,對消化液敏感性強,通過控制適當的消化時間可以純化細胞,一般經3次～5次傳代純化,就可以得到較純的成纖維細胞[14]。本試驗的研究結果和上述研究相一致,奶山羊胎兒成纖維細胞原代及前3代都混有一些上皮樣細胞,直到第4代才分離到純化的胎兒成纖維細胞。另外,原代細胞的培養中,污染成為困擾著我們的一個常見問題,本試驗在原代細胞的培養液里加入了200單位/mL的雙抗,很好的防止了原代細胞的污染,這和馬忠輝等[15]的做法相同。本試驗分離的奶山羊胎兒成纖維細胞系生長曲線呈“S”型,細胞表現為明顯的3個分期,潛伏期、對數生長期和平臺期。接種第1～2天的細胞處于恢復期,細胞數量基本變化不大;從第2天后進入對數生長期;3 d～5 d為增殖高峰期,5 d后進入平臺期,細胞逐漸長滿,7 d后細胞出現接觸抑制而開始死亡。該細胞生長曲線表明,符合體外細胞的生長特征,具有正常的細胞生物學特性。對體細胞介導的基因打靶生產轉基因動物而言,從細胞轉染到獲得陽性克隆至少需要20 d以上,相當于細胞8代以上。到轉基因細胞進行核移植時,細胞在體外至少培養了10代以上,因而核供體細胞需要有較好的增殖活性而又不容易發生染色體的畸變。本試驗應用流式細胞儀測定第4代和第15代奶山羊胎兒成纖維細胞細胞周期和倍性。通過對這兩代細胞測定結果進行對比分析,以第4代胎兒成纖維細胞作為二倍體對照,第15代細胞仍為二倍體細胞,沒有發生染色體變異。另外,細胞周期分析表明,細胞在體外傳了15代后,其增殖活性仍然很好,和第4代細胞相比,沒有多大變化。因而此細胞系可以用于細胞篩選,在獲得陽性克隆后作為轉基因克隆的供體細胞。

3.2 SRY-PCR法胎兒性別鑒定

目前性別鑒定的方法有許多種,如染色體核型分析法,細胞免疫學方法,DNA探針法及SRY-PCR法等。這幾種方法相比較,SRY-PCR方法具有特異性強,靈敏度高,操作方便快捷且準確(準確率達95%～100%)的優點,因而成了一種廣泛應用的方法。SRY是在不同動物中高度保守的雄性Y染色體上性別決定區的基因[16]。SRY基因的表達決定了胚胎向雄性方向分化,因此可通過特異性擴增SRY基因的核心序列對動物胚胎或細胞進行性別鑒定。曾溢濤等通過對SRY基因核心序列HMG盒測序設計引物對奶牛胚胎進行性別鑒定,準確率達100%[17]。Harely V R等[18]從SRY基因核心序列以外的片段擴增產物鑒定了人和牛早期胚胎的性別。本試驗根據設計的SRY基因擴增引物可以從陽性對照公山羊血液基因組有效的擴增出337 bp的預期片段,而陰性對照母山羊血液基因組卻未能擴增出該片段。說明,含有相同337 bp特性一片段GFF2為雄性細胞系,而不含該特異性條帶的GFF1為雌性細胞系。序列測定及同源性分析進一步證明擴增產物為SRY基因片段,說明該試驗設計的引物可用于PCR擴增準確鑒定山羊胎兒成纖維細胞的性別。PCR擴增技術的高靈敏性,極易受到污染,影響鑒定結果。因而在操作過程中要注意,比如要建立空白對照,吸頭、離心管均高壓滅菌,一次性使用;戴一次性手套,配制PCR預混液等,盡量減少因操作不當而造成的污染。另外,本試驗采用了復合PCR,就是在同一個反應環境中,使用多對PCR引物對多個基因進行擴增。我們根據山羊β-乳球蛋白基因設計了一對內標引物,同時進行PCR反應。這樣可以避免因基因組提取不當或操作過程中的失誤而造成的假陰性。

本試驗成功分離培養了兩株奶山羊胎兒成纖維細胞系,并對細胞系進行了SRY-PCR性別鑒定,GFF1為雌性,GFF2為雄性。細胞生長曲線與細胞周期及倍性分析表明,這兩株細胞系活力旺盛,能夠進行長時間的體外培養,適于作為體細胞核移植的供體細胞,為高產優勢奶山羊新品種的培育奠定了基礎。

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Isolation and Culture of Diary Goat Fetal Fibroblasts and Sex Indentification by SRY Gene

CHEN Hua-tao,HU Lin-yong,YANG Yan,LI Qian,JIN Ya-ping

(Key Laboratory of Animal Reproductive Endocrinology and Embryo Biotechology of Agriculture Ministry of China,College of Veterinary Medicine,Northwest A&F University,Y angling,Shaanxi,712100,China)

In order to explore and establish the method for isolation,cultivation,and sex identification of dairy goat fetal fibroblasts(GFFs)in vitro,obtain the donor cells for dairy goat transgenic cloning,two dairy goat fetal fibroblast cell lines passing through separation and purify were obtained by tissue explant attachment.The GFFs were examined by cell morphology,growth curve,cell cycle and DNA ploidy.A pair of PCR primers were designed to identify the sex of GFF cell lines according to the goat SRY gene,the other pair of inner reference PCR primers were designed according to the goat BLG gene,the SRY-PCR reaction system was established and the two GFF cell lines were identified.T he cytological bioactivity of the isolated cell lines was excellent,they could grow and proliferate quicklyin vitro.T he positive control sample and GFF2 sample obtained the PCR fragment of 337 bp and the BLG gene PCR fragment of 498 bp.However,the negative control sample and the GFF1 sample did not amplify the PCR fragment of 337 bp.The PCR fragment of 337 bp was cloned into pMD19-T vector and the pSRY recombinant vector was constructed,then the vector was sequenced by M13 universal primers.The result of sequence determined that the corresponding gene is partial SRY gene fragment.The result indicated that the cell line with 337 bp fragment is male.This study laid the foundation for breeding new breed of transgenic dairy goat.

dairy goat;fetal fibroblast;SRY gene;sex identification

Q813.11

A

1007-5038(2010)08-0001-07

2010-05-14

國家轉基因生物新品種培育重大專項(2008ZX08008-004)

陳華濤(1984-),男,安徽碭山人,碩士研究生,主要從事家畜生殖內分泌與轉基因動物新品種培育研究。