兩種根管沖洗方法聯(lián)合不同沖洗液對糞腸球菌作用的體外研究

陳建洪 李玲 唐倩 陸超云 黃嫻嫻

根管內(nèi)感染物質(zhì)的存在是影響根管治療質(zhì)量的重要因素之一。因此，如何有效去除根管內(nèi)的感染物質(zhì)是成功的重要前提。根管沖洗液通過機械沖刷作用以及化學(xué)溶解作用，配合有效的根管預(yù)備，可將大部分的感染物質(zhì)去除。研究［1，2］證明，不同的根管沖洗方法與沖洗液對去除感染物質(zhì)的效果不盡相同。

糞腸球菌(E.faecalis)常可在慢性持續(xù)性根尖周損害或再次治療的根管中檢測出，是根管治療的頑固菌。研究發(fā)現(xiàn)［3］，這與糞腸球菌可進入牙本質(zhì)小管，同時對營養(yǎng)缺乏的環(huán)境有極大耐受力有顯著關(guān)系。因此，如何最大程度的去除牙本質(zhì)小管內(nèi)的糞腸球菌對治療結(jié)果有很大影響。次氯酸鈉是對糞腸球菌效果較好的沖洗液［4］，然而較高濃度對根尖周組織的刺激性較大。超聲根管沖洗是近年來普遍應(yīng)用于口腔臨床的沖洗方法，與人工注射器沖洗相比，其有效性已經(jīng)越來越得到肯定［1］。另外，糞腸球菌是相對容易培養(yǎng)的細(xì)菌，利用糞腸球菌的體外根管感染模型來檢測藥物的抗菌作用已經(jīng)得到了許多學(xué)者的贊同［5］。本實驗研究目的旨在通過培養(yǎng)體外糞腸球菌的感染模型，來觀察超聲根管沖洗以及17%EDTA與不同濃度的次氯酸鈉沖洗液組合對糞腸球菌的清除效果。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選擇2009年6月至2010年1月在中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院口腔科因正畸需要減數(shù)拔牙的健康單根前磨牙58例，患者年齡:14～22歲。納入標(biāo)準(zhǔn):單直通暢根管，根尖孔均發(fā)育完全，無近髓齲壞或近髓充填體，未做過牙髓治療，無根尖吸收、根裂等其他缺陷。

1.2 離體牙預(yù)備 將實驗牙去除根周軟組織、牙石等，清洗干凈后置于生理鹽水中4℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｇ谐拦冢Ａ粞栏L度為15mm。常規(guī)消毒拔髓，采用Protaper器械冠向下法進行根管預(yù)備，首先用鎳鈦擴孔鉆敞開根管口，按照S1、S2、F1、F2、F3的順序進行根管預(yù)備至 30#(04 錐度)，根管預(yù)備過程中每換一次器械用0.9%NaCl2ml勻速沖洗，時間為1min。預(yù)備完畢后，根尖孔及以上2mm區(qū)域用環(huán)氧樹脂(日本株式會社)封閉。高溫高壓消毒30min備用。隨機選取2個標(biāo)本置于裝有5ml新鮮配制的無菌牛心腦浸液(brain heartinfusionbroth，BHI，Sigma 公司)培養(yǎng)液的試管內(nèi)，每天更換新鮮培養(yǎng)液，通過分光光度計檢測A值觀察培養(yǎng)液渾濁度以確定消毒效果。

1.3 感染模型的建立 將保存于-70℃冰箱中的糞腸球菌(標(biāo)準(zhǔn)株ATCC29212)解凍復(fù)蘇后，接種于新鮮配制的BHI培養(yǎng)基中，37℃厭氧條件下培養(yǎng)24h。用生理鹽水稀釋，使菌液密度為3×108CFU/ml，與麥?zhǔn)媳葷峁芤恢隆⑴渲坪玫木阂?00UL/根管接種到56顆離體牙中，10min內(nèi)操作完畢。將標(biāo)本放于盛有BHI培養(yǎng)基的24孔板中，37℃下CO2孵育箱中孵育培養(yǎng)21d，隔日更換一次新鮮培養(yǎng)菌液。并隨機抽取任一標(biāo)本菌液進行微生物檢測，根據(jù)菌落形態(tài)、革蘭染色、觸酶試驗，確定無雜菌污染后則繼續(xù)實驗，若發(fā)現(xiàn)污染，則實驗立即終止。

1.4 實驗分組:按照隨機數(shù)字表分別采用超聲根管沖洗法以及人工注射器沖洗法進行根管沖洗，每組根據(jù)沖洗液的不同分為四小組，分別為17%EDTA+1%NaClO(A組)、17%EDTA+2.5%NaClO(B 組)、5.25%NaClO(C 組)、0.9%NaCl(D組 陽性對照組)，每組7個標(biāo)本。

1.5 感染模型的取樣及細(xì)菌培養(yǎng)計數(shù)

1.5.1 第一次取樣(N1) 根管沖洗前用30#無菌紙尖按照工作長度插入根管中停留1min，吸取根管內(nèi)液，立即放入裝有1ml生理鹽水的Eppendorf管中混勻，分別接種于BHI血瓊脂平皿上，37℃下CO2孵育箱中培養(yǎng)，48h后計數(shù)菌落數(shù)(CFU/ml)，記為樣本 N1。

1.5.2 第二次取樣(N2) 手動不銹鋼K銼繼續(xù)預(yù)備根管中下段至50#，每更換一次器械時分別以A、B、C、D組液配以兩種沖洗方法進行根管沖洗，詳見1.6。最后用2ml無菌生理鹽水沖洗根管，以避免沖洗液的過度作用。立即用30#無菌紙尖按照根管長度插入根管中停留1min，吸取根管內(nèi)液送培養(yǎng)計數(shù)，記為樣本N2。

1.6 沖洗方法 超聲根管沖洗組:在超聲治療儀(法國賽特力公司)上用30號超聲根管銼按照根管長度放入根管，后退2mm，不做旋轉(zhuǎn)及提拉動作，盡量避免接觸根管壁，4ml各組沖洗液(A、B組 EDTA、NaClO各2ml)超聲振動沖洗1min;人工注射器沖洗組:使用5ml注射器針管和1ml側(cè)向開口的注射器針頭，沖洗時將注射器針頭沿根管側(cè)壁放入根管深部，達工作長度后后退2mm，以無阻力，不嵌塞，回流通暢為準(zhǔn)，并不時上下，左右移動針頭，4ml各組沖洗液(A、B組 EDTA、NaClO各2ml)勻速緩慢沖洗，速度為4ml/min。

1.7 細(xì)菌菌落計數(shù) 用取樣槍取Eppendorf管中液體0.5 ml，10倍系列稀釋，接種于BHI培養(yǎng)基，37℃厭氧培養(yǎng)48h之后計數(shù)菌落形成單位(CFU)。

1.8 細(xì)菌復(fù)蘇實驗 第二次取樣后，在根管內(nèi)分別插入四根飽含BHI液體培養(yǎng)基的紙尖，37℃下CO2孵育箱中培養(yǎng)72h后夾出紙尖放入BHI液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)48h，肉眼見培養(yǎng)基變渾濁并根據(jù)菌落形態(tài)、革蘭染色實驗以及觸媒實驗來確定是否有其他微生物感染。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析 將細(xì)菌計數(shù)結(jié)果按lg(CFU/ml)做對數(shù)轉(zhuǎn)換，利用方差分析做統(tǒng)計學(xué)處理。見表1。

表1 兩種沖洗方法及不同沖洗液對糞腸球菌的作用

2 結(jié)果

通過單因素分析方差分析(One-wayANOVA)，無論在超聲根管沖洗組或是在人工注射器沖洗組，A、B、C、D四組中的糞腸球菌量在沖洗前均無顯著差異(超聲組F=1.7758，P=0.1786＞0.05;人工組 F=1.2748，P=0.3054＞0.05)。而各組沖洗后的細(xì)菌量與沖洗前均存在顯著差異(超聲組F=168.7702P=0.0000 ＜0.05;人工組 F=180.5105，P=0.0000＜0.05)。其中，A、B、C三組沖洗液與陽性對照組D組相比，均存在顯著性差異(P＜0.05)，見表2。同時，A、B、C三組的差值兩兩比較，B組與 A、C組均存在顯著差異(P＜0.05)，而A、C組之間無顯著差異(P＞0.05)，見表3。將超聲根管沖洗與人工注射器沖洗相比較，發(fā)現(xiàn)在A組與C組中，兩種方法存在顯著的差異，前者明顯優(yōu)于后者。而在B組中，兩者無顯著差異，見表4。細(xì)菌復(fù)蘇實驗發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)液變渾濁。

表2 A、B、C三組沖洗液與D組統(tǒng)計學(xué)比較

表3 A、B、C三組沖洗液兩兩對照

表4 兩種沖洗方法在不同沖洗液組中的差值

3 討論

糞腸球菌是呼吸道及腸道中的常駐菌之一，在口腔也常可檢測到，是一種重要的條件致病菌。它與久治不愈的慢性根尖周損害或經(jīng)再次治療的根管感染有顯著關(guān)系，經(jīng)PCR檢測，可達到70%左右［6］，由于其治療的復(fù)雜性，已越來越成為研究的熱點。

關(guān)于糞腸球菌的致病機制尚未完全明了，主要與以下幾個方面有關(guān)［7］:①糞腸球菌形態(tài)多樣，體積小，可進入牙本質(zhì)小管內(nèi)，同時其分泌的絲氨酸蛋白酶、明膠酶、膠原凝結(jié)蛋白可促進與牙本質(zhì)進一步結(jié)合;②糞腸球菌可以延長自身的生存周期，使分裂繁殖基本處于靜止?fàn)顟B(tài)，來對抗?fàn)I養(yǎng)缺乏的外界環(huán)境，一旦有足夠的營養(yǎng)物質(zhì)，饑餓細(xì)胞可迅速恢復(fù)活性;③糞腸球菌可以抑制多形核中性粒細(xì)胞向下調(diào)節(jié)α4細(xì)胞黏附分子的表達水平，導(dǎo)致多形核中性粒細(xì)胞無法針對糞腸球菌發(fā)揮作用;④在高pH值條件下仍可存活;⑤糞腸球菌與其他細(xì)菌細(xì)胞競爭形成的生物膜對其自身具有很好的保護作用;有研究表明，糞腸球菌所形成的生物膜使糞腸球菌耐受吞噬作用.抗原抗體反應(yīng)以及抗菌劑的能力比無生物膜的細(xì)菌高出一千倍。另外，糞腸球菌生物膜常存在于根管的中下段、狹窄區(qū)及死區(qū)，物理性的器械預(yù)備及根管沖洗難以完全消除感染物質(zhì)，這對于其治療增加了難度。

理想的根管消毒藥物應(yīng)滿足以下條件［8］:①較強的抗菌效果;②有效溶解有機組織;③去除根管涂層;④對根尖周組織無毒性。目前，尚無一種理想的消毒藥物能完全殺滅糞腸球菌。樟腦氯酚雖然殺菌效果較強，然而以其為代表的苯酚類藥物由于可能具有致畸、致突變的副作用，已不推薦使用;同時臨床上經(jīng)常使用的消毒藥物氫氧化鈣已經(jīng)證明了對其效果不佳［9］;近年來，有關(guān)實驗［10］認(rèn)為中藥制劑五倍子水提取物對糞腸球菌的殺菌效果較好，同時其毒副作用小，不易產(chǎn)生耐藥性，但是關(guān)于其確切療效尚在進一步研究中。

次氯酸鈉經(jīng)研究證明對糞腸球菌具有很好的療效［11］，同時可以溶解有機殘髓。但是由于不能有效去除玷污層，其表面張力亦同時抑制了進入牙本質(zhì)小管的能力。而EDTA可與金屬鈣離子形成易溶的螯合物，軟化根管牙本質(zhì)，達到脫礦消除玷污層及牙本質(zhì)碎屑的效果，兩者聯(lián)合應(yīng)用，可達到相互補償相互增效的作用［12］。本文分別選擇17%EDTA+1%Na-ClO、17%EDTA+2.5%NaClO、5.25%NaClO 與生理鹽水做對照，發(fā)現(xiàn)三者抑制糞腸球菌的能力均明顯高于對照組，說明次氯酸鈉對糞腸球菌具有較好的作用。三組沖洗液對比研究中發(fā)現(xiàn)，17%EDTA+2.5%NaClO組明顯優(yōu)于其他兩組，這與劉漪等［13］的實驗結(jié)果相類似。而17%EDTA+1%NaClO與5.25%NaClO效果無明顯差異，證明EDTA與NaClO聯(lián)合應(yīng)用，其效果優(yōu)于單獨用 NaClO來進行根管沖洗。研究證明［14］，次氯酸鈉的殺菌效果隨著濃度的升高而增強。而其細(xì)胞毒性亦與濃度成正比，高濃度的次氯酸鈉可造成根尖周組織劇烈的疼痛、腫脹和出血。考慮到抑菌和根尖周組織反應(yīng)的雙重效應(yīng)，從本文試驗結(jié)果看，17%EDTA+2.5%NaClO為推薦使用的沖洗組合。

與傳統(tǒng)的人工注射器沖洗方法相比，超聲根管沖洗通過超聲的熱效應(yīng)、聲流效應(yīng)和“空穴效應(yīng)”來作用于根管，尤其是加上“超聲協(xié)同系統(tǒng)”大量的液體交換，可使沖洗液中有效的殺菌成份得到補充，從而獲得高效的沖洗和清理效果。本實驗A、C兩組中，兩種沖洗方法后的糞腸球菌量比較有明顯統(tǒng)計學(xué)意義，說明超聲根管沖洗對清除糞腸球菌有明顯效果，這可能與超聲聲流效應(yīng)，能夠有效地溶解和松解根管內(nèi)的壞死組織，使側(cè)副根管和牙本質(zhì)小管內(nèi)的細(xì)菌進入主根管，徹底清除附著在根管壁上的污染層有關(guān)［1］。同時由于糞腸球菌生物膜位于根管中下段、死區(qū)、狹窄區(qū)，普通的人工注射器沖洗難以到達，因此減弱了對糞腸球菌的抑制作用。而B組中，兩種沖洗方法無顯著性差異，這可能與17%EDTA+2.5%NaClO本身的抑菌效果較強，沖洗后菌量較少而無統(tǒng)計學(xué)意義有關(guān)。

本文實驗結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，在陽性對照組D組中，沖洗后與沖洗前的細(xì)菌量相比亦有統(tǒng)計學(xué)意義。說明根管預(yù)備對于去除糞腸球菌也有一定的效果。由于糞腸球菌一般位于根管中下段，因此在常規(guī)根管預(yù)備后，需繼續(xù)擴大根管中下段以清除進入牙本質(zhì)小管中的糞腸球菌。而細(xì)菌培養(yǎng)實驗發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)液變渾濁，證明根管清理后仍然有細(xì)菌的存在，說明上述根管預(yù)備方法配合沖洗液尚不能完全去除糞腸球菌。

綜上所述，次氯酸鈉對于糞腸球菌具有一定的抑菌效果，而聯(lián)合EDTA使用，優(yōu)越性更加顯著。本文實驗結(jié)果推薦使用17%EDTA+2.5%NaClO作為清除糞腸球菌的根管沖洗液。另外，相對于人工注射器沖洗而言，超聲根管沖洗去除糞腸球菌的能力更明顯。因此對于難治性的感染根管或再治療的根管而言，推薦使用超聲根管沖洗以取得比較好的療效。

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