稀土元素鈰對若干淡水綠藻的毒性作用

許曉路，孫金艷，徐冬梅

(浙江樹人大學 生物與環境工程學院，浙江 杭州 310015)

稀土是一種具有特殊性質的礦產資源，在工業、養殖業、國防和醫藥等領域得到廣泛應用［1-3］。我國稀土資源豐富，稀土儲量及產量均居世界首位。自1984年以來，我國稀土的年產量增長率均在20%以上，尤其以石化、印染、制革及農業的應用發展最為迅速［4］。這使得稀土元素及其化合物大量進入環境，特別是隨著工業廢水的排放和農田地表徑流進入水體，對水生生態環境構成潛在威脅，并通過食物鏈而影響人類健康。

綠藻是水生生態系統中重要的初級生產者，關系到水體生產力和水體生態平衡。藻類對于外來物質的刺激反應十分敏感，環境變化會出現藻類種群結構及生物多樣性的變化，從而引起水質的相應變化。同時藻類對富營養水體的凈化起著重要作用，其中某些種類，特別是小球藻屬的存在與否可作為水質評價的重要指標［5-6］。鈰是應用較多的稀土元素之一。本研究通過綠藻模擬培養試驗，在不同的鈰濃度下測定綠藻的半數效應濃度 (EC50)、生物量、葉綠素含量、蛋白質含量及若干理化指標，為污染物排放標準和環境質量標準制定提供基礎資料。

1 材料和方法

1.1 試劑

稀土鈰購自北京有研稀土新材料股份有限公司，用少量濃硝酸將氧化鈰溶解再用蒸餾水稀釋，配置成質量濃度為2 000 mg·L-1的標準硝酸鈰溶液作為母液備用。

硫酸銨 (NH4)2SO4、硫酸鎂 (MgSO4·H2O)、土壤浸出液、碳酸氫鈉 (NaHCO3)、氯化鉀(KCl)、氯化鐵 (FeCl3)1%(m/m)、過磷酸鈣、90%丙酮、考馬斯亮藍 G-250試劑、對二甲苯、95%乙醇、牛血清蛋白、濃硝酸、pH值7.8的磷酸緩沖液均為分析純。

1.2 實驗藻類

斜生柵藻及蛋白核小球藻購自中國科學院水生生物研究所。培養基為水生4號 (HB-4)人工培養液［7］:(NH4)2SO40.20 g·L-1，過磷酸鈣 0.03 g·L-1，MgSO4·H2O 0.08 g·L-1，NaHCO30.10 g·L-1，KCl 0.025 g·L-1， 1%FeCl3(m/m)0.15 mL，土壤浸出液0.50 mL。將藻種在無菌條件下接種至水生4號人工培養液中，于智能人工氣候箱恒溫光照培養至對數生長期，并進一步擴大培養。培養方法:用1 000 mL三角瓶，移取400～600 mL水生4號人工培養液，接種藻種使之成淡綠色。用4層紗布封口以防污染，培養溫度為(24±1.0)℃，4 500～5 000 lx連續靜止培養。每天定時搖動4～5次，以減少水藻細胞貼壁現象，并盡可能保證對藻液光照均勻。為防止藻種老化，10 d接種1次。

1.3 儀器與設備

JY92-2 D超聲波細胞粉碎機 (寧波新芝生物科技股份有限公司)、JI KA-1000臺式離心機、AvantiJ-E立式大容量冷凍離心機、制冰碎冰機、智能人工氣候箱 (寧波海曙賽福實驗儀器廠)、超純水機、PB-10 E PH計、LDZX-40Ⅱ型 立式自動電熱壓力蒸汽滅菌器 (上海申安醫療器械廠)、CS101-3 EB電熱鼓風干燥器、KSW電阻爐溫度控制器4-10(沈陽市節能電爐長)、101 A-3B型 電熱鼓風干燥箱 (上海市實驗儀器總廠)、BS224S電子天平、UV-2450紫外/可見分光光度計、SKF-6 A超聲波清洗器、SW-CJ-1 F單人雙面凈化工作臺、HI9142溶解氧儀。

1.4 急性毒性實驗的綠藻培養

取進入對數生長期藻液作為接種藻液，各處理組加入不同量的硝酸鈰溶液 (表1-2)。光照時間16 h，黑夜8 h，光照強度4 500～5 000 lx，培養溫度為 (24±1.0)℃連續靜止培養。每個處理濃度設置3個平行。

表1 蛋白核小球藻的急性實驗設計

分別于培養24，48，72，96 h后取樣，在波長689 nm處測定藻液光密度，建立不同藻類細胞密度 (105，縱坐標)和光密度 (橫坐標)之間線性關系，以計數的藻細胞濃度和光密度表示藻生物量，通過兩者線性關系進行檢驗。

1.5 慢性毒性實驗的綠藻培養

取進入對數生長期藻液作為接種藻液，各處理組加入不同量的硝酸鈰溶液 (表3-4)。光照時間16 h，黑夜8 h，光照強度4 500～5 000 lx，培養溫度為 (24±1.0)℃，連續靜止培養。每個處理濃度設置3個平行。測定培養96和192 h時的吸光度。并在192 h后按實驗設計測定其它指標。

表2 柵藻的急性實驗設計

表3 蛋白核小球藻的慢性實驗設計

表4 柵藻的慢性實驗設計

1.6 藻細胞計數

采用血球計數板在顯微鏡下直接計數，計算方法:藻細胞 (mL)=(N/5×25)/10-5×n。

式中:N表示5個中方格內數得藻細胞數;10-5為計數室的體積;n為藻液的稀釋倍數。

1.7 綠藻急性毒性即96 h半效應濃度測定

藻生物量的測定:分別取藻原液 0，0.25，0.50，1.00，2.00，4.00，6.00，8.00 和 10.00 mL定容至10 mL，再分別測定各濃度下的藻液吸光值，并且用血球計數板對各濃度下的藻細胞進行計數，最后根據吸光度和細胞數做出生物量標準曲線。

光密度測定:取待測藻液5 mL，在波長 λ=689 nm處測其光密度。

半效應濃度:硝酸鈰對淡水綠藻的毒性試驗采用有毒化學品對藻類的毒性測試的標準方法［8］確定硝酸鈰對淡水綠藻的96 h半效應濃度，初步試驗使硝酸鈰呈幾何級數增加，用預實驗計算出抑制淡水綠藻的96 h半效應濃度。正式試驗硝酸鈰濃度以初步確定的96 h EC50為中點，各向兩邊以等差數列形式延伸濃度并和一組對照同時進行測定［8-9］。96 h半效應濃度越大說明淡水綠藻對硝酸鈰抵抗能力越強，反之則說明敏感性越大。

1.8 藻液可溶性蛋白含量的測定

可溶性蛋白質含量采用考馬斯亮藍法測定，以小牛血清蛋白作標準曲線［10］。具體測定步驟如下:已測定光密度的藻液40 mL放入離心管→12 000 r·min-1下離心30 min，倒出離心清液，將離心管倒置滴干→加入3 mL 0.05 mol·L-1pH值7.8的磷酸緩沖液，冰浴→超聲波細胞破碎儀破碎30 min，鏡檢無完整藻細胞→定容到5 mL，離心，取上清液→595 nm處測吸光度。以 mg·g-1表示［11］。

標線制作方法:配制100 μg·mL-1標準蛋白、0.15 mol·L-1NaCl溶液及考馬斯亮藍試劑，取7只試管按表5加入各試劑后在595 nm下測定吸光度。

小牛血清蛋白標線:y=1.660 6 x+0.009 4，R2=0.990 4。

表5 小牛血清蛋白標準曲線制作方法

1.9 葉綠素含量的測定

藻液抽濾 (離心)后轉入具塞刻度試管迅速轉移至冰箱冷凍室-20℃冷凍過夜，取出后立即加入預熱80℃的10 mL95%乙醇萃取，并在恒溫水浴鍋中80℃萃取2 min，緊接著在超聲波細胞粉碎儀上 (冰浴)中進行浮游植物細胞粉碎 (300 W，3，5，50 s)，在冰箱4℃下黑暗靜置4 h后于80-2型臺式離心機4 000 r·min-1離心10 min，取上清液待測［12］。

測定方法:用光徑1 cm比色皿于波長665 nm和750 nm處測吸光值，然后加3滴1 mol·L-1鹽酸酸化，1 min后于波長665 nm和750 nm處再測吸光值。

計算方法:c(Chl-a乙醇)=27.9×［(D665，D-D750， D)- (D665， B-D750， B )］ ×V乙醇/V水樣。

式中:c(Chl-a乙醇)為乙醇法測定的葉綠素a質量濃度 (μg·L-1);A665，D和 D750，D分別為乙醇萃取液酸化前于665 nm和750 nm處的吸光值;D665，B和D750，B分別為乙醇萃取液酸化后于665 nm和750 nm處的吸光值，V乙醇為乙醇萃取液的體積 (mL)，V水樣為離心水樣的體積 (L)。

1.10 其它理化指標的測定

用溶解氧儀和pH計在培養192 h后測定相應指標。

2 結果與分析

2.1 藻細胞生物量

隨著鈰濃度增加，蛋白核小球藻和柵藻生物量不斷增加，兩者呈線性相關 (表6)。

表6 蛋白核小球藻和柵藻生物量

蛋白核小球藻生物量曲線:y=210.5x+2.201，R2=0.993 3。

柵藻生物量曲線:y=126.78x+0.121 1，R2=0.994 4。

2.2 96 h半數效應濃度

對淡水綠藻進行急性毒性實驗以確定半數效應濃度EC50即為50%藻生長抑制率=(空白吸光度-處理吸光度)/空白吸光度 ×100%［13］。

以蛋白核小球藻的96 h時測定的3組平行光度的平均值為 y，以硝酸鈰濃度為 x，即 y=0.001 7 x+0.313 9，R2=0.316 1。可見，硝酸鈰對蛋白核小球藻的毒性在0～10 mg·L-1時急劇下降，在10～20 mg·L-1時變化較緩。其96 h半數效應濃度為29.9 mg·L-1。

以柵藻的96 h時測定的3組平行光度的平均值為 y，以硝酸鈰濃度為 x，即 y=0.001 5 x+0.261 4，R2=0.554 5。可見，硝酸鈰對柵藻的毒性作用，在0～10 mg·L-1時毒性作用明顯增強，隨后趨緩，20～40 mg·L-1時作用明顯。其96 h半數效應濃度為63.6 mg·L-1。

2.3 藻液可溶性蛋白含量

蛋白質含量是表征細胞狀態的重要指標。本研究將細胞破碎后通過吸光度對蛋白質含量進行了測定，探究硝酸鈰對藻類蛋白質含量的影響。結果(圖1-2)表明，硝酸鈰濃度10 mg·L-1處理后藻液的可溶性蛋白含量變化不明顯。

2.4 葉綠素含量

綠藻的葉綠素含量代表其光合作用能力。在作用192 h后測其含量發現其出現明顯差異，表明生物量、水體自凈能力受到明顯影響 (圖3-4)。

從圖3可見，硝酸鈰濃度從0～10 mg·L-1其葉綠素含量下降迅速，尤其是在2.5～5.0 mg·L-1的毒性作用最大，其它濃度范圍則變化較為平緩。圖4顯示，硝酸鈰濃度在2.5 mg·L-1時可促進葉綠素含量的增長，2.5～5.0 mg·L-1時急劇下降，5～10 mg·L-1無明顯變化，其它濃度都存在平緩下降趨勢。綠藻的葉綠素含量代表其光合作用能力。高濃度的硝酸鈰影響綠藻，水體的自凈能力受到明顯影響。

2.5 理化指標

2.5.1 pH值

Ce(NO3)3·6 H2O母液的 pH值為4.55。但加入培養基后pH值都有了不同程度的增加。

圖1 蛋白核小球藻蛋白質吸光度

圖2 柵藻蛋白質吸光度

圖3 蛋白核小球藻葉綠素含量

從圖5可見，培養基對硝酸鈰有一定的緩沖作用，能使其p H值增大。但是隨著濃度的增加，培養基的緩沖作用能力下降。圖6表明，培養基對硝酸鈰的緩沖作用并不明顯。

2.5.2 溶解氧

圖4 柵藻葉綠素含量

圖5 蛋白核小球藻的pH值

圖6 柵藻的pH值

溶解氧 (DO)是水生生物生存不可缺少的條件，反映了水體自凈能力。溶解氧的一個來源是水中溶解氧未飽和時，大氣中的氧氣向水體滲入;另一個來源是水中植物通過光合作用釋放出的氧。溶解氧除了被水中硫化物、亞硝酸根、亞鐵離子等還原性物質所消耗外，同時也被水中微生物的呼吸作用以及水中有機物質被好氧微生物的氧化分解所消耗。對于人類而言，健康的飲用水中溶解氧含量不得小于6 mg·L-1。氧對水中生物如魚類的生存有著至關重要的影響，當溶解氧低于4 mg·L-1時，就會引起魚類窒息死亡 (圖7-8)。

圖7 蛋白核小球藻的溶解氧

圖8 柵藻的溶解氧

從圖7-8可見，相同濃度硝酸鈰對不同藻類作用不同。但當硝酸鈰濃度達10 mg·L-1以上時水體溶解氧含量在5.8 mg·L-1以下，值得關注。

3 小結

已有研究表明，稀土元素對藻類也屬中、低毒性，且低濃度時反而有一定的刺激生長作用。稀土對水生藻類等水生植物生長的影響，一般取決于稀土元素種類本身，而與其化合物類型則關系不大。本次實驗發現:低濃度的硝酸鈰對綠藻的生長有一定的促進作用。隨著濃度的增大，它的抑制作用開始顯現;隨著藻體生物量的變化，其葉綠素、蛋白質含量也隨之增減;水體p H值有所上升。

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