rhBNP對急性心肌梗死再灌注后急性期細胞因子、心肌凋亡的實驗研究

崔麗杰，李占全，袁 龍，張薇薇，趙鴻梅，彭妍鈺

（遼寧省人民醫(yī)院心內(nèi)科，遼寧沈陽 110016）

腦利鈉肽（brain natriuretic peptide，BNP）是由 32個氨基酸殘基組成的17環(huán)狀多肽，BNP通過與其受體結(jié)合，從而介導(dǎo)一系列生理學(xué)效應(yīng)，上述生理學(xué)作用可以明顯改善心功能。實驗證實，通過敲除BNP基因，心房肽（ANP）或BNP或其相應(yīng)受體受到破壞，可以導(dǎo)致血壓上升和（或）心肌纖維化的發(fā)生；BNP通過改善腎臟功能或通過神經(jīng)激素的作用，降低心室內(nèi)壓力和緩解失代償性心力衰竭患者的呼吸困難。重組人腦利鈉鈦（rhBNP），國外商品名為奈西利肽，已經(jīng)被美國FDA批準為急性失代償性心力衰竭治療的一線用藥，它的另一個治療應(yīng)用前景為心肌梗死后的早期治療。有個案報道急性心肌梗死（AMI）后應(yīng)用重組人ANP對左室重構(gòu)有利[1]，但對于心肌梗死后階段早期應(yīng)用奈西利肽少有報道。本研究旨在觀察AMI再灌注后早期應(yīng)用rhBNP對急性期細胞因子及心肌凋亡的影響，為尋求新的治療AMI的方法提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康成年雌性雜種犬15只，體重12～20 kg，購自中國藥科大學(xué)實驗動物中心。

1.2 方法

1.2.1 AMI再灌注模型的構(gòu)建及實驗分組 術(shù)前禁食8 h，3%戊巴比妥鈉（30 mg/kg）麻醉后，將犬仰臥固定于操作臺上，右股動脈穿刺置入6F動脈鞘管，穿刺對側(cè)股靜脈置入6F鞘管備補液及搶救用藥。經(jīng)股動脈彈丸式注入肝素鈉2 500 U，每隔1 h左右追加肝素鈉1 250 U。冠脈指引導(dǎo)管行冠脈造影，后置入PTCA導(dǎo)絲，在導(dǎo)絲指引下置入（2.0～2.5）mm×（9～15）mm的人PTCA球囊至左前降支（LAD）或左旋支（LCX）中段以下，球囊經(jīng)缺血預(yù)適應(yīng)3～4次，打開球囊，造影顯示球囊遠端血流中斷。90 min后撤除球囊，重新造影示封堵冠脈血流再通。保留左冠脈guilding指引導(dǎo)管，備冠脈取血及冠脈內(nèi)用藥。術(shù)中1只犬麻醉過量，2只犬出現(xiàn)室顫死亡；其余12只犬模型制作成功。實驗犬隨機分為rhBNP組和對照組。rhBNP組以凍干rhBNP（商品名新活素，0.5 mg/支；西藏諾迪康藥業(yè)股份有限公司，國藥準字S20050033）以0.9 μg/kg冠脈注射＞3min；后以 0.06 μg/（kg·min）靜脈滴注 60 min。 對照組以等體積生理鹽水作同期對照。

1.2.2 細胞因子檢測 術(shù)前及球囊封堵后90、210 min股靜脈采血5 ml，球囊封堵后90 min于左冠脈采血5 ml，置于加有1.5 mg/ml乙二胺四乙酸（EDTA）的抗凝管中，室溫下1 000 g離心15 min后取血漿1.5 ml置于指形試管中，將所有標本置于-80℃冰箱保存，采用酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法測量血漿BNP、ET-1水平。嚴格按說明書操作。

1.2.3 梗死邊緣心肌細胞凋亡檢測 PTCA術(shù)后210 min應(yīng)用10%氯化鉀注射液15～20 ml靜推處死動物，于心尖部沿短軸方向剖開心臟，沿心臟短軸將心臟切為橫斷組織塊（厚度約2 mm），在梗死邊緣心肌取材，置于10%中性甲醛固定液中固定24 h，組織包埋后石蠟切片，原位細胞死亡檢測試劑盒檢測凋亡心肌細胞含量（AI）。嚴格按說明書操作。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（x±s）表示，計數(shù)資料以頻數(shù)表示，采用SPSS 13.0軟件分析，計量資料統(tǒng)計采用多因數(shù)方差分析、配對t檢驗及成組t檢驗，計數(shù)資料采用χ2檢驗或Fisher精確概率法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組基線資料

兩組犬在體重、梗死相關(guān)動脈及冠脈優(yōu)勢情況方面差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2 兩組血漿BNP水平比較

見表1。

表1 兩組血漿BNP水平比較（x±s，pg/ml）

2.3 兩組血漿ET-1水平比較

見表2。

表2 兩組血漿ET-1水平比較（x±s，pg/ml）

2.4 兩組凋亡心肌比較

rhBNP組凋亡陽性細胞指數(shù)為（17.5±2.9）%，對照組為（24.5±3.6）%，兩組比較，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

3 討論

心肌在較長時間缺血造成一定損傷后，恢復(fù)供血不但不減輕或逆轉(zhuǎn)損傷，反而加重損傷，這種現(xiàn)象稱為缺血-再灌注損傷。在缺血-再灌注過程中，內(nèi)皮細胞受到刺激合成并釋放ET-1，后者有很強的縮血管作用，導(dǎo)致血管增殖，加重心室和血管的纖維化，同時也是其他神經(jīng)內(nèi)分泌物質(zhì)的強化因子，并參與調(diào)節(jié)BNP合成和釋放[2-3]。因此，本研究以AMI再灌注血清學(xué)水平觀察血漿BNP、ET-1水平的變化，探討應(yīng)用rhBNP對心臟的保護作用。本研究顯示，對照組犬在球囊封堵后90 min血漿ET-1水平有所升高，再灌注2 h后的血漿ET-1水平明顯升高，提示再灌注后ET-1合成和釋放增多，這與Tonnessen等[4]的報道一致，犬在球囊封堵90 min后血漿BNP水平有所升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，提示BNP未能與ET-1相平衡，這符合既往結(jié)論[5]；210 min后血漿BNP水平則顯著升高，提示可能出現(xiàn)心功能不全，這也符合心衰犬的BNP可信區(qū)間[6]。冠脈血漿BNP和ET-1水平高于術(shù)前外周血相應(yīng)因子水平，提示冠脈內(nèi)細胞因子變化更明顯，缺血早期心肌內(nèi)啟動了自我調(diào)節(jié)機制，是一個對急性組織損傷的急性期反應(yīng)；且也為缺血-再灌注后即刻冠脈應(yīng)用rhBNP提供時間依據(jù)。rhBNP組術(shù)后210 min外周血BNP及ET-1水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義，提示外源性應(yīng)用rhBNP可能對內(nèi)皮細胞有一定的保護作用，減少缺血-再灌注損傷。

心肌缺血-再灌注可致冠狀血管及心肌受損，ANP及BNP孵化的人類中性粒細胞能調(diào)節(jié)細胞功能，并減弱其介導(dǎo)的內(nèi)皮細胞毒性作用。在冠脈再灌注治療中應(yīng)用低劑量利鈉肽，能夠限制短暫性冠狀動脈阻塞所致的心肌細胞死亡[7]。Fiscus等[8]采用原位末端標記技術(shù)發(fā)現(xiàn)缺血-再灌注大鼠心肌細胞中有典型的凋亡形態(tài)改變，認為細胞凋亡是缺血-再灌注損傷的特征之一。本實驗發(fā)現(xiàn)，rhBNP組凋亡心肌數(shù)量顯著低于對照組，提示應(yīng)用rhBNP可減少凋亡，對心臟有保護作用，這也與有關(guān)報道相符。

綜上所述，AMI再灌注早期應(yīng)用rhBNP可減少梗死后再灌注損傷，但由于本實驗的樣本有限，在今后的研究中需進一步擴充樣本量，為臨床AMI患者觀察再灌注損傷提供參考。

[1]Hideyo K,Kenichi O,Akitugu O,et al.Administration of atrial natriuretic peptide attenuates reperfusion phenomena and preserves left ventricular regional wall motion after direct coronary angioplasty for acute myocardial infarction[J].Circ J,2003,67(5):443-448.

[2]Piuhola J,Szokodi I,Ruskoaho H.Endothelin-1 and angiotensin II contribute to BNP but not c-fos gene expression response to elevated load in isolated mice hearts[J].Biochim Biophys Acta,2007,1772(3):338-344.

[3]Toma I,Nagy A,Jánosi C,et al.Effects of intrapericardially administered endothelin-1 on pericardial natriuretic peptide concentrations of the in situ dog heart[J].J Cardiovasc Pharmacol,2004,44(Suppl 1):S231-233.

[4]Tonnessen T,Naess PA,Kirkeboen KA,et al.Release of endothelin from the porcine heart after short term coronary artery occlusion[J].Cardiovasc Res,1993,43(8):1482-1485.

[5]Keiko M,Takayoshi T,Atsuyuki W,et al.Insufficient secretion of atrial natriuretic peptide at acute phase of myocardial infarction[J].Appl Physiol,2000,89(2):458-464.

[6]Prosek R,Sisson DD,Oyama MA,et al.Distinguishing cardiac and noncardiac dyspnea in 48 dogs using plasma atrial natriuretic factor,B-type natriuretic factor,endothelin,and cardiac troponin-I[J].J Vet Intern Med,2007,21(2):238-242.

[7]Padilla F,Garcia K,Agullo LB,et al.Intravenous administration of the natriuretic peptide urodilatin at low doses during coronary reperfusion limitsinfarctsizeinanesthetizedpigs[J].CardiovaseRes,2001,51(3):592-600.

[8]Fiscus RR,Tu AW,Chew SB,et al.Natriuretic peptides inhibit apoptosis and prolong the survival of serum-deprived PC12 cells[J].Neuroreport,2001,12(2):185-189.