HPLC測定野老鸛草中沒食子酸和鞣花酸的總量

金 欣， 王 鋒， 姚 嵐， 吳秋月， 王琪琳， 劉麗芳

（中國藥科大學中藥分析教研室，江蘇南京 211198）

HPLC測定野老鸛草中沒食子酸和鞣花酸的總量

金 欣， 王 鋒， 姚 嵐， 吳秋月， 王琪琳， 劉麗芳*

（中國藥科大學中藥分析教研室，江蘇南京 211198）

野老鸛草；HPLC；沒食子酸；鞣花酸；含量測定

目的：建立野老鸛草中沒食子酸和鞣花酸總量測定的方法。方法：采用HPLC法。色譜條件：色譜柱為Diamonsil C18（2）色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈-0.1%磷酸溶液梯度洗脫；流速為1.0 mL/min；檢測波長為274 nm；柱溫為25℃。結果：沒食子酸和鞣花酸的線性范圍分別是：0.075～5.00 μg（r=0.999 5）、0.05～2.00 μg（r=0.999 5），平均回收率分別是97.9%（RSD=0.53%）、102.6%（RSD=2.14%）。結論：本法簡便、準確、重復性好，可用于野老鸛草藥材的質量評價。

老鸛草是我國常用中藥，《中國藥典》2005版中收載正品老鸛草為牻牛兒苗科植物牻牛兒苗Erodium stephanianum Willd.、老鸛草 Geranium wilfordii Maxim.或野老鸛草Geranium carolinianum L.的干燥地上部分［1］。據文獻報道［2］老鸛草的主要成分為鞣質、黃酮類、有機酸及揮發油等，其具有廣譜抗菌、抗病毒及抗氧化等多種藥理作用［3，4］。其中鞣質類化合物老鸛草素及其分解產物是抗氧化作用的主要成分，具有抗氧化、維持體內自由基的穩定和平衡、消除有害的自由基反應、中斷脂質過氧化、減少脂質過氧化產物等作用［5，6］。沒食子酸和鞣花酸為老鸛草素的主要分解產物，本文采用高效液相色譜法同時對目前我國老鸛草藥材的主流品種——野老鸛草中沒食子酸和鞣花酸的總量進行了測定。該研究為制定野老鸛草的質量標準和對野老鸛草藥材的進一步開發利用提供了科學依據。

1 儀器與試藥

Agilent 1100 HPLC Series液相色譜儀（Agilent公司，美國）；Diamonsil C18（2）色譜柱，（150 mm×4.6 mm，5 μm）（Dikma 公司，美國）；KH3200E 型超聲波清洗器（昆山禾創超聲儀器有限公司）；沒食子酸對照品（中國藥品與生物制品檢定所，批號：110831-200302）；鞣花酸對照品（自制，純度大于98%（HPLC））。老鸛草全部由中國藥科大學中藥學院劉麗芳副教授鑒定為野老鸛草Geranium carolinianum L.，標本存放于中國藥科大學中藥分析實驗室；乙腈為色譜純（Dikma公司，美國）；水為樂百氏純凈水；其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱采用Diamonsil C18（2）色譜柱，（150 mm ×4.6 mm，5 μm）。流動相為乙腈-0.1%磷酸溶液，洗脫程序見表1。流速1.0 mL/min，檢測波長274 nm，柱溫25℃。色譜圖見圖1。

表1 洗脫程序

2.2 溶液的制備

圖1 沒食子酸（A）、鞣花酸（B）、野老鸛草（C）的HPLC色譜圖

2.2.1 供試品溶液的制備 取本品細粉約1 g（過4號篩），精密稱定，置錐形瓶中，加鹽酸-50%甲醇（10%（v/v））50 mL，加熱回流0.5 h，濾過。殘渣同法再提取1次，濾過，合并濾液，減壓蒸干溶劑，殘渣用50%甲醇溶解并定容至50 mL量瓶中，搖勻，精密移取10 mL蒸干，殘渣用50%甲醇溶解并定容至25 mL量瓶中，搖勻，用微孔濾膜（0.45 μm）濾過，取續濾液，即得。

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取沒食子酸對照品適量，加50%甲醇制成每1 mL中含50 μg的溶液；精密稱取鞣花酸對照品適量，加二甲基亞砜制成每1 mL中含50 μg的溶液，即得。

2.3 標準曲線的繪制

2.3.1 沒食子酸標準曲線的繪制 精密吸取0.25 mg/mL的沒食子酸對照品溶液0.15、1.00、3.00、5.00、7.00 mL加50%甲醇稀釋定容至10 mL，搖勻，分別進樣20 μL，用上述色譜條件測定。以進樣量（μg）為橫坐標，測得的峰面積積分值為縱坐標繪制標準曲線，回歸方程：Y=2 752.5X+54.156，r=0.999 5。結果表明在0.075～5.00 μg之間有良好的線性關系。

2.3.2 鞣花酸標準曲線的繪制 精密吸取0.10 mg/mL的鞣花酸對照品溶液 0.25、1.50、2.50、3.50、5.00 mL加二甲基亞砜稀釋定容至10 mL，搖勻，分別進樣20 μL，用上述色譜條件測定。以進樣量（μg）為橫坐標，測得的峰面積積分值為縱坐標繪制標準曲線，回歸方程：Y=2 998.7X+44.347，r=0.999 5。結果表明在0.05～2.00 μg之間有良好的線性關系。

2.4 穩定性試驗 精密吸取供試品溶液（南京（080604）），分別于 0、3、6、9、12、24 h 測定，沒食子酸RSD=2.48%，鞣花酸RSD=4.65%，表明供試品溶液在24 h內穩定。

2.5 精密度試驗 精密吸取等體積的對照品溶液注入液相色譜儀，重復6次，沒食子酸RSD=0.34%，鞣花酸RSD=2.23%，表明儀器精密度良好。

2.6 重復性試驗 取同一樣品（南京（080508））5份，按“2.2.1”項方法制備，在2.1項條件下測定，總沒食子酸含量分別為0.305 9%、0.311 8%、0.317 5%、0.310 5%、0.305 0%，平 均 值 為0.310 1%，RSD=1.62%；總鞣花酸含量分別為0.106 5%、0.103 4%、0.102 6%、0.106 8%、0.105 1%，平均值為0.104 9%，RSD=1.77%，表明方法的重復性良好。

2.7 檢測限及定量限 分別將沒食子酸和鞣花酸對照品溶液逐漸稀釋后進樣，取S/N=3時的濃度為檢測限，經測定，沒食子酸檢測限為0.075 μg/mL，鞣花酸檢測限為0.25 μg/mL；取S/N=10時的濃度為定量限，經測定，沒食子酸定量限為0.25 μg/mL，鞣花酸定量限為 0.70 μg/mL。

2.8 回收率試驗 精密稱取已知含量的樣品（山東（0708200308））共6份，分別精密加入一定量的沒食子酸對照品和鞣花酸對照品，混勻后，按2.9項方法測定含量，計算平均回收率，結果見表2。

表2 回收率測定結果（山東（0708200308））

結果表明，本法具有較好的準確性。

2.9 樣品的含量測定 取14批樣品，經干燥、粉碎后，按2.2.1項方法處理。精密吸取供試品溶液，進樣20 μL，用外標法測定含量，結果見表3。

表3 樣品測定結果

3 討論

3.1 精密稱取同一批樣品9份，分別考察了時間為0.5、1、2 h，鹽酸濃度為 5%、10%、20%，溶劑為30%甲醇、50% 甲醇、70% 甲醇，體積為 25、50、75 mL的4因素3水平的正交試驗，結果表明，時間為0.5 h，鹽酸濃度為10%，溶劑為50%甲醇，體積為50 mL，提取2次為最優方案。

3.2 老鸛草素（geraniin）屬于可水解鞣質中的鞣花鞣質（ellagitannin），加水分解時分解為沒食子酸（gallic acid）、六羥基聯苯二甲酸（hexahydroxydiphenic acid）、鞣花酸（ellagic acid）、柯里拉京（corilagin）、云實酸（brevifolincarboxylic acid）、云實素（brevifolin）［5］，見圖 2。

圖2 老鸛草素及其分解產物

據文獻報道［6-8］，沒食子酸對結腸運動呈現顯著的抑制作用，因此老鸛草總鞣質（HGH）有較好的治療腹瀉作用；鞣花酸具有抗氧化功能，抗癌、抗突變性能，對人體免疫缺陷病毒有抑制作用。本次實驗采用高效液相色譜法同時對野老鸛草中沒食子酸和鞣花酸的含量進行測定。我們在實驗中發現，野老鸛草的50%甲醇提取物中成分組成非常復雜，樣品不經水解直接進樣分析，70 min內有包括上述兩種待測成分在內的80多個色譜峰被分離出來，因此，樣品液不經水解直接分析所需時間長，且對色譜柱的柱效要求非常高，給分析測定帶來一定的難度。兩種含量相對較高的待測成分平均值也僅為0.125 2%和0.175 8%。而將樣品水解后，由于多種多酚類化合物具有相同的水解產物，因而使樣品溶液所含成分大大減少，所需分析時間縮短，柱效要求更適中，水解后樣品中沒食子酸和鞣花酸總量平均值達到0.804 1%和0.342 4%。綜合上述原因，我們將該藥材水解后再進行含量測定。

3.3 我們從各地共收集藥材樣品14批，除一批從云南藥材公司購置的鮮藥材經鑒定為尼泊爾老鸛草（G.nepalense Sweey.）外，其它藥材均為野老鸛草（G.carolinianum L.）的干燥地上部分。由此說明，該種目前為老鸛草藥材的主流品種。樣品測定結果表明，各地野老鸛草水解后的沒食子酸含量在0.137 3% ～1.786 1%之間，平均值為0.804 1%；鞣花酸含量在0.017 9% ～0.782 8%之間，平均值為0.342 4%。各批藥材中沒食子酸和鞣花酸含量的差異可能與產地氣候，采收期等因素有關，值得進一步探討。

［1］中國藥典［S］.一部.2005：80.

［2］金晴昊，崔京浩，郭建鵬.老鸛草的研究進展［J］.時珍國醫國藥，2005，16（9）：840-841.

［3］Küpeli E，Tatli I I，Akdemir Z S，et al.Estimation of antinociceptive and anti-inflammatory activity on Geranium pratense subsp.Finitimum and its phenolic compounds［J］.J Ethnopharmacol，2007（114）：234-240.

［4］LI Jiyang，Huang Hai，Zhou Wei，et al.Anti-hepatitis B Virus Activities of Geranium carolinianum L.Extracts and Identification of the Active Components［J］.Biol Pharm Bull，2008，31（4）：743-747.

［5］杜曉鳴，郭永泗.老鸛草素及抗氧化作用［J］.國外醫藥·植物藥分冊，1990，5（2）：57-61.

［6］鄒建華.尼泊爾老鸛煎液成分對離體腸管運動的影響［J］.國外醫學·中醫中藥分冊，1993，15（4）：44-45.

［7］王麗敏，盧春風，路雅真.老鸛草鞣質類化合物的抗腹瀉作用研究［J］.黑龍江醫藥科學，2003，26（5）：29-30.

［8］丁運生，孫小虎，李有桂，等.鞣花酸及其衍生物研究進展［J］.合肥工業大學學報（自然科學版），2008，31（11）：1809-1812.

Determination of gallic acid and ellagic acid in Geranium carolinianum L.by HPLC

JIN Xin， WANG Feng， YAO Lan， WU Qiu-yue， WANG Qi-lin， LIU Li-fang*
（Department of Analysis of Chinese Medicine，China Pharmaceutical University，Nanjing 211198，China）

Geranium carolinianum L.；HPLC；gallic acid；ellagic acid；determination

AIM：To establish a method for determining gallic acid and ellagic acid in Geranium carolinianum L..METHODS：An HPLC method was performed on a Diamonsil C18column（150 mm ×4.6 mm，5 μm）with acetonitrile-0.1%H3PO4as mobile phase.The flow rate was 1.0 mL/min，the detection wavelength was set at 274 nm and the column temperature was at 25℃.RESULTS：The calibration curve of gallic acid and ellagic acid were linear in the range of 0.075 ～5.00 μg（r=0.999 5）and 0.05 ～2.00 μg（r=0.999 5），respectively.The average recovery of gallic acid and ellagic acid were 97.9%（RSD=0.53%）and 102.6%（RSD=2.14%），respectively.CONCLUSION：The method is simple，accurate and suitable for the quality control for this herb.

R284.1

A

1001-1528（2010）07-1172-05

2009-09-18

國家藥典委員會2010版一部標準研究課題（YS-229，YS-230）

金 欣（1985－），女，在讀碩士研究生，主要從事中藥制劑分析研究。Tel：（025）86185373

*通訊作者：劉麗芳（1969－），女，博士，副教授，主要從事中藥活性成分和動物藥研究。Tel：（025）86185446 E-mail：liulifang69@126.com